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¿Cómo se sintetiza la cantidad correcta de nucleótidos durante la recombinación homóloga?

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Estoy leyendo sobre la recombinación homóloga en el contexto de la reparación de roturas de doble cadena. Parece que el truco es que alrededor de la ruptura, la recombinación homóloga usa un dúplex de plantilla para generar cierta superposición entre las partes rotas, de modo que las hebras puedan repararse de forma complementaria. Sin embargo, al leer de la plantilla, dúplex ininterrumpido, parece que es muy importante exactamente cuántos nucleótidos se generan para formar la superposición entre las dos hebras rotas. Demasiado poco, y no se forma superposición ya que las hebras rotas todavía forman dos secuencias disjuntas. Demasiado, y las piezas rotas ya no encajan, hay partes dobladas. Es como un rompecabezas donde algunas piezas describen regiones superpuestas.

¿Cómo sabe la polimerasa agregar exactamente la cantidad correcta de nucleótidos?


Inicio de la recombinación homóloga en las mellas del ADN

Las discontinuidades en una sola hebra del dúplex de ADN ocurren con frecuencia, como resultado del daño del ADN o como intermediarios en procesos nucleares esenciales y reparación del ADN. Las mellas son las más simples de estas lesiones: tienen extremos limpios con grupos 3′-hidroxilo que pueden someterse a ligadura o cebar una nueva síntesis de ADN. Por el contrario, las roturas de una sola hebra también interrumpen solo una hebra de ADN, pero llevan extremos dañados que requieren limpieza antes de los pasos posteriores de reparación. A pesar de su aparente simplicidad, las mellas pueden tener consecuencias importantes para la estabilidad del genoma. La disponibilidad de enzimas que pueden introducir una mella en casi cualquier parte de un genoma grande ahora permite analizar sistemáticamente la reparación de las mellas. Experimentos recientes demuestran que las mellas pueden iniciar la recombinación a través de vías distintas de las activas en las roturas de doble cadena (DSB). La recombinación en las mellas de ADN dirigidas puede ser muy eficaz y, dado que las mellas son intrínsecamente menos mutagénicas que las DSB, la corrección génica iniciada por mellas es útil para la ingeniería del genoma y la terapia génica. Esta revisión revisa algunos ejemplos fisiológicos de recombinación en las mellas y describe experimentos que han demostrado que las mellas inician la reparación dirigida por homología por vías distintivas, enfatizando la investigación que ha contribuido a nuestra comprensión mecanicista actual de la recombinación en las mellas en células de mamíferos.


Secuencias de nucleótidos homólogas en los extremos 5 & # x27 de los ARN mensajeros sintetizados a partir de las familias de genes de enolasa de levadura y gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa. La estructura primaria de un tercer gen de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa de levadura.

Se ha aislado ADN genómico que contiene un tercer gen estructural de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa de levadura en un plásmido bacteriano denominado pgap11. Se determinó la secuencia de nucleótidos completa de este gen estructural. El gen no contiene secuencias intermedias, el uso de codones está muy sesgado y la secuencia de nucleótidos de la porción codificante de este gen es 90% homóloga a los otros dos genes de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (Holland, JP y Holland, MJ (1980). ) J. Biol. Chem. 255, 2596-2605). Según el grado de divergencia de la secuencia de nucleótidos entre los tres genes de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, es probable que surgieran como consecuencia de dos eventos de duplicación y el gen contenido en el plásmido híbrido denominado pgap11 es un producto del primer evento de duplicación. . Los tres genes estructurales comparten una amplia homología de secuencia de nucleótidos en las regiones no codificantes 5 & # x27 adyacentes a los tres codones de iniciación de la traducción respectivos. Sin embargo, el gen contenido en pgap11 no es homólogo a los demás aguas abajo del codón de terminación de la traducción respectivo. Los extremos 5 & # x27 de los ARN mensajeros sintetizados a partir de los tres genes de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa y dos de levadura enolasa se han mapeado en sitios que varían de 36 a 82 nucleótidos cadena arriba de los respectivos codones de iniciación de la traducción. En cada caso, el terminal 5 & # x27 del ARNm se asigna a una región de fuerte homología de secuencia de nucleótidos que es compartida por los cinco genes estructurales. Estos últimos datos confirman que los cinco genes estructurales se expresan durante el crecimiento celular vegetativo y respaldan aún más la hipótesis de que una porción de la región flanqueante no codificante 5 & # x27 de los genes de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa y enolasa de levadura evolucionó a partir de una secuencia precursora común .


Capítulo 15 - Mecanismos de transferencia horizontal de genes y recombinación de ADN

La genómica comparada está revelando una gran diversidad dentro de muchas especies bacterianas. El pangenoma de una especie está compuesto por genes centrales presentes en todas las cepas y genes prescindibles que proporcionan una ventaja selectiva en condiciones específicas. El movimiento de estos genes prescindibles entre especies, géneros y reinos se conoce como transferencia horizontal de genes (HGT). Hay tres mecanismos principales de HGT en bacterias. Transformación: captación de ADN desnudo del medio ambiente por células naturalmente competentes. Transducción: transferencia de ADN bacteriano entre células utilizando bacteriófagos como vectores. Conjugación: contacto íntimo de célula a célula con transferencia de ADN monocatenario mediante un sistema de secreción tipo IV.

El ADN adquirido horizontalmente que no puede replicarse de forma autónoma debe integrarse en el genoma del receptor si se quiere mantener. El ADN entrante con similitud significativa con el genoma del receptor puede integrarse mediante recombinación homóloga. Los elementos genéticos móviles, como los elementos integradores y conjugativos, que tienen una homología limitada con el genoma del huésped, utilizan la recombinación específica del sitio para integrarse en las secuencias diana. La comprensión de estos procesos proporciona información sobre la evolución de las bacterias y los patógenos emergentes.


Abstracto

La proteína 7 de la nucleocápside del virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1 NCp7) es un componente principal del complejo de transcripción inversa. Se ha estudiado su efecto sobre la transcripción inversa y la recombinación homóloga. in vitro en condiciones experimentales estrictamente idénticas. Para altas concentraciones de enzimas, NCp7 no estimuló la síntesis de ADN. El curso de tiempo para la finalización de la transcripción inversa, así como la procesividad y el patrón de pausa fueron similares en presencia o ausencia de NCp7. Sin embargo, la adición de NCp7 afectó significativamente el rendimiento de la reacción, una disminución exacerbada a medida que aumentaba la longitud del ARN copiado. Atribuimos este fenómeno a una desestabilización del dúplex ARN / ADN en etapas intermedias de la transcripción inversa.

Por el contrario, NCp7 potenció la recombinación homóloga durante la síntesis mediada por la RT del VIH-1 (transcriptasa inversa), como sucedió con la RT del virus de la leucemia murina de Moloney. En el ARN desnudo, el proceso de recombinación dependía de la concentración de RT, lo que sugiere que la unión de RT a un intermedio de transferencia de cadena era el paso limitante. Esta dependencia se alivió en presencia de NCp7. Este efecto no implica una interacción directa entre RT y NCp7, ya que se obtuvieron resultados similares cuando se sustituyó NCp7 por la chaperona de ARN bacteriano StpA. Por tanto, el efecto dominante de NCp7 se ejerce muy probablemente en el nivel de condensación de las plantillas de ARN, lo que conduce a la formación de interacciones productivas entre el ADN naciente y la plantilla aceptora.


¿Cómo se sintetiza la cantidad correcta de nucleótidos durante la recombinación homóloga? - biología

1. & # 9 ¿Cuál de las siguientes afirmaciones sobre la ADN polimerasa es correcta?

a) & # 9 Agrega unidades de desoxirribonucleótido al 3'-hidroxilo de un cebador.

b) & # 9 Utiliza la hebra molde para seleccionar la unidad de desoxirribonucleótido para agregar a la cadena de ADN en crecimiento.

c) & # 9 Contiene una nucleasa 3 '& # 213 5' que escinde los enlaces fosfodiéster para producir 3'-dNMPs y ADN terminado en 3'-fosfato. producen extremos 3'-OH.

d) & # 9 Contiene dos actividades nucleasa en la misma cadena polipeptídica que contiene el sitio activo de la polimerasa.

e) & # 9 Se puede escindir con una proteasa en dos fragmentos, cada uno de los cuales tiene actividad nucleasa.

COMENTARIOS: A diferencia del ADN pol I, el ADN pol III no tiene una 5'-exonucleasa y, por lo tanto, no puede eliminar los cebadores de ARN de los fragmentos de Okazaki. Sin embargo, la pol III es más "procesadora" que la pol I y puede interactuar con otras proteínas necesarias para la replicación, como el complejo primasa-helicasa.

2. & # 9 ¿Qué propiedad del ADN permite la reparación de algunos residuos dañados por la acción de mutágenos? La complementariedad de las dos hebras permite recuperar la información mediante el uso de la hebra no dañada como plantilla.

3. & # 9 ¿Cómo identifica la maquinaria de reparación de E. coli una hebra de ADN que recientemente incorporó incorrectamente un nucleótido no complementario durante la replicación para repararlo? A través de la vía de reparación de errores de emparejamiento dirigida por metilo.

4. & # 9 ¿Cuál de las siguientes enzimas o procesos pueden participar en la reparación del ADN en E. coli dañado por la formación de un dímero de timina inducida por la luz ultravioleta?

a) La ligasa de ADN # 9 sella la hebra recién sintetizada al ADN no dañado para formar la molécula intacta.

b) & # 9 La enzima UvrABC (excinucleasa) hidroliza los enlaces fosfodiéster en ambos lados del dímero de timina.

c) & # 9DNA polimerasa I llena el espacio creado por la eliminación del oligonucleótido que lleva el dímero de timina.

d) & # 9 La enzima UvrABC reconoce una distorsión en la hélice de ADN causada por el dímero de timina.

e) La enzima fotorreactivante # 9A absorbe la luz y escinde el dímero de timina para volver a formar dos residuos de timina adyacentes.

COMENTARIOS: No hablé de la fotorreactivación en las conferencias. Este sistema enzimático, que es muy eficaz en bacterias, parece estar ausente en los seres humanos, excepto quizás en algunos linfocitos. La presencia de una reparación eficaz del ADN en los linfocitos puede ayudar a disminuir los efectos dañinos sobre el sistema inmunológico de los rayos UV-A del sol (325-400nM), que penetran más profundamente en las capas de la piel que los rayos UV-B y UV-C (& lt325nM).

5. & # 9 Los seres humanos que padecen xeroderma pigmentoso desarrollan cánceres de piel cuando se exponen a la luz solar porque tienen una deficiencia en:

d) una enzima de la vía de reparación de la escisión.

e) una enzima de la ruta de reparación de errores de apareamiento.

COMENTARIOS: Consulte las conferencias del Dr. Hamori.

6. & # 9 Si la citosina en el ADN está desaminada, la base resultante es:

a) & # 9 eliminado por una endonucleasa.

b) & # 9 eliminado por una exonucleasa.

c) & # 9 eliminado por una glicosilasa.

d) & # 9no eliminado, pero finalmente reemplazado por citosina en la replicación del ADN posterior.

e) no es reconocido por la ADN polimerasa y, por tanto, inhibe la replicación del ADN.

RESPUESTA: C específicamente la uracil-N-glicosilasa.

7. & # 9 El ADN eucariota está altamente metilado en la posición C-5 de la citosina. El grado de metilación se correlaciona inversamente con la expresión génica. Aunque se desconoce el papel exacto de la metilación de C-5 en la expresión génica, se sabe que estas citosinas C-5-metiladas son una fuente de mutaciones. Explicar por qué

RESPUESTA: Porque cuando la 5-metilcitosina se desamina oxidativamente se convierte en "timina", que es una base de ADN normal y no es eliminada por las glicosilasas. En última instancia, conduce a mutaciones de transición (C a T) (Me-C: G & # 174 T: G & # 174 T: A & amp C: G)

8. & # 9 Explique los principios de la reparación del ADN propenso a errores.

RESPUESTA: La reparación propensa a errores ocurre cuando la síntesis de ADN "sin plantilla" procede sobre una posición de nucleótido modificada o abásica (base perdida) en el ADN. Dos tercios de las veces, las mutaciones son transversiones.

Reordenamientos del ADN: recombinación y transposición.

1. & # 9 ¿Cuáles de las siguientes afirmaciones sobre reordenamientos genéticos son correctas?

a) & # 9 Generan nuevas combinaciones de genes.

b) & # 9 Pueden mover un segmento de ADN de un cromosoma a otro.

c) & # 9 Están mediadas por la rotura del ADN y la unión de los fragmentos resultantes.

d) & # 9 Generan variabilidad de la secuencia del genoma, sobre la cual puede actuar la selección natural.

e) & # 9Pueden regular la expresión génica.

f) & # 9 Siempre requieren extensas regiones de similitud de secuencia entre las moléculas de ADN que interactúan para yuxtaponer los sitios de recombinación. Ni la recombinación específica de sitio ni la transposicional requieren una gran similitud entre las moléculas de ADN recombinantes

2. & # 9 Resume los pasos de la recombinación homóloga.

Consulte la página 802 en Libro de texto. Necesita conocer el tipo de enzimas y otras actividades utilizadas por este proceso.

3. & # 9 ¿Cuáles de las siguientes afirmaciones sobre la proteína RecA de E. coli son correctas?

a) & # 9 Es una nucleasa dependiente de ATP que genera ADN monocatenario. La actividad nucleasa está en Rec B C D

b) & # 9 Cataliza una reacción de asimilación de cadena dependiente de ATP en la que una molécula de ADN monocatenario se asocia con ADN dúplex.

c) & # 9 Hidroliza ATP para promover la migración de ramas.

d) & # 9 Se une al ADN monocatenario para formar un filamento.

e) & # 9 Facilita la búsqueda de ADN dúplex para regiones con similitud de secuencia con el ADN monocatenario invasor.

4. & # 9 Es probable que la recombinación homóloga requiera cuál de los siguientes?

a) & # 9DnaB protein & # 9g) & # 9Proteína de unión de una sola hebra

b) & # 9 Topoisomerasa I & # 9h) & # 9 ARN polimerasa dependiente de ADN

c) & # 9RecA proteína & # 9i) & # 9DNA polimerasa I

d) & # 9RecBCD complejo & # 9j) & # 9DNA ligasa

La recombinación homóloga implica cierta síntesis de reparación de ADN entre moléculas recombinantes. También requiere algunas de las proteínas utilizadas para la replicación del ADN. No se requiere DnaB.

5. & # 9 ¿Cuál de las siguientes afirmaciones sobre los transposones es correcta?

a) & # 9 Contienen secuencias de inserción.

b) & # 9 Contienen secuencias de repetición de terminales invertidas.

c) & # 9 Contienen uno o más genes que especifican una o más enzimas que catalizan el evento de transposición.

d) & # 9 Requieren que los productos del gen rec completen sus movimientos entre o dentro de los genomas. Estos son necesarios para la recombinación homóloga.

e) & # 9 Pueden conducir a la duplicación de secuencias cortas de ADN en el genoma del receptor. A cada lado del ADN insertado.

Se ha considerado que el tipo de recombinación que presentan los transposones, a veces denominada recombinación independiente de RecA, tiene una importancia evolutiva mucho mayor que la recombinación general o dependiente de RecA. ¿Por qué cree que este puede ser el caso?

RESPUESTA: Porque permite la transferencia horizontal de nuevos casetes de genes, por ejemplo, grupos de genes que especifican la resistencia a los fármacos. La recombinación homóloga tiene un papel más importante en la reordenación de los alelos de genes homólogos en pares de cromosomas.

7. & # 9 Describa cuatro formas diferentes por las cuales un gen de resistencia a los antibióticos podría pasar del ADN genómico de una bacteria al ADN genómico de otra.

RESPUESTA: A través de la transferencia de plásmidos en la conjugación bacteriana, a través de un virus por transducción, a través de la captación de ADN liberado de células moribundas (es decir, transformación) o mediante transposición (que puede estar asociada con conjugación, transducción o transformación).

8. & # 9 & # 9 Las transposasas reconocen secuencias suficientemente extensas que rodean los sitios de integración para que el transposón evite integrarse en el medio de un gen, porque la alteración del gen podría ser letal para la célula. Falso. Los transposones a menudo se integran en el interior e inactivan ("anulan") genes.

9. & # 9 La capacidad de los plásmidos para replicarse indefinidamente sin ser parte de un cromosoma huésped los distingue de los elementos transponibles. Cierto

1. & # 9 ¿Cuáles de las siguientes sustituciones de nucleótidos son mutaciones de transición?

2. & # 9 ¿Cuáles de las sustituciones en la pregunta 1 son mutaciones de transversión?

3. & # 9 Explique por qué la mayoría de los nucleótidos que se han incorporado incorrectamente durante la síntesis de ADN en E. coli no conducen a una progenie mutante. Debido a que la edición 3'-exonucleasa de la ADN polimerasa III y la vía de reparación de desajustes dirigida por metilo generalmente eliminan los errores que permiten reemplazos con nucleótidos incorporados correctamente.

4. & # 9 Haga coincidir el tipo de mutación o consecuencia fisiológica en la columna de la derecha con el mutágeno apropiado en la columna de la izquierda. Es posible que deba buscar algunos de estos compuestos.

d) Acridinas 4,5 _____________

4) Desplazamiento de marco traslacional.

e) Ácido nitroso ________ 2 _______

f) Benza [a] pirina ________ 4,5 _ ____

EXPLICACIÓN: Los análogos de bases como el 5-bromouracilo y la 2-aminopurina se incorporan en lugar de las bases naturales correspondientes y generalmente conducen a mutaciones de transición cuando existen en estados ionizados o nativos que tienen propiedades de emparejamiento de bases diferentes de las bases naturales. El compuesto 5-bromouracilo se incorpora bastante bien en lugar de timina (5-metiluracilo) y codifica como timina (es decir, se empareja con adenina en replicaciones posteriores) sin embargo, se presenta en forma ionizada con más frecuencia que la timina y, como consecuencia, crea más incorporaciones erróneas A: C y C: A durante la replicación. En replicaciones posteriores, estas incorporaciones erróneas se convierten en mutaciones de transición. El compuesto 2-aminopurina incorpora, en niveles bajos, en lugar de guanina (2-amino, 6-oxipurina) y es un mutágeno muy potente que causa las misicorporaciones de G: T y T: G, es decir, también es un mutágeno de transición. .

Los compuestos que conducen a desaminaciones oxidativas (al reaccionar con los grupos NH2 de A, G y C) conducen a transiciones. En esencia, cambian el grupo lateral donante de H (NH2) a un grupo lateral que acepta H (= O). La hidroxilamina y el ácido nitroso pertenecen a esta categoría de mutágenos.

Los compuestos hidrofóbicos planos como los colorantes de acridina y la pirina Benza [a] se intercallan en el ADN y aumentan la frecuencia de deslizamiento durante la replicación del ADN, lo que conduce a mutaciones de cambio de marco. La presencia de un agente intercalante en el ADN de doble hebra puede causar una pausa en la replicación que generalmente se supera mediante el deslizamiento que conduce a cambios de marco.

5. & # 9 Si la ADN polimerasa comete un error, creando así un par de bases con enlaces de hidrógeno incorrectos, el error se corrige mediante un sistema especial de reparación de desajustes que utiliza metilación para distinguir las hebras nuevas de las viejas.

6. & # 9 La enzima que replica el virus del VIH es la ____transcriptasa inversa, que carece de actividad 3'-exonucleasa (edición) _ y, en consecuencia, tiene poca fidelidad.

7. & # 9 Cuando actúa sobre el ADN replicado, el sistema de reparación de errores de apareamiento dirigido por metilo en E. coli puede distinguir la hebra parental de la hebra de la progenie siempre que una o ambas estén metiladas, pero no si ambas hebras no están metiladas. ¿Verdadero o falso?

RESPUESTA: Falso. Este sistema de reparación funciona solo si una hebra está metilada en las secuencias GATC y la otra no.

8. & # 9 ¿Cuáles de las siguientes afirmaciones sobre la holoenzima de la ADN polimerasa III de E. coli son correctas?

a) & # 9 Alarga una cadena de ADN en crecimiento aproximadamente 100 veces más rápido que la ADN polimerasa I. Pol III es más procesiva que pol I.

b) & # 9 Se asocia con la plantilla parental, agrega algunos nucleótidos a la cadena en crecimiento y luego se disocia antes de iniciar otro ciclo de síntesis. Esto es lo que sucede con una enzima no procesadora.

c) & # 9 Mantiene una alta fidelidad de replicación, en parte actuando junto con una subunidad que contiene una actividad exonucleasa 3 '& # 213 5'.

d) & # 9 Cuando se replica el ADN, es un ensamblaje molecular compuesto por al menos 10 tipos diferentes de subunidades. Las subunidades & # 98 (& # 98 dímero) de este conjunto es el factor de "procesividad".

1. & # 9 Hay varios términos que debe agregar a su vocabulario. Estos se enumeran en las páginas 842-843 de Voet & amp Voet. Asegúrate de no perderte ninguno.

2. & # 9 Trabaje "Ejercicios de estudio" 1-7 al final del Capítulo 25 en Voet & amp Voet.

3. & # 9 Trabaje con los "Problemas" 1, 3 y 5 al final del Capítulo 25 antes de buscar las respuestas al final del libro.

4. & # 9 La subunidad sigma de la ARN polimerasa de E. coli

& # 9A. & # 9es parte de la enzima central.

B. & # 9 une el antibiótico rifampicina. Es la subunidad & # 98 la que se une a la rifampicina.

C. & # 9 es inhibida por & # 97 -amanitina Esta toxina de ciertos hongos inhibe la RNA polimerasa II eucariota

D. & # 9 debe estar presente para que se produzca la transcripción. & # 115 solo se requiere para la iniciación.

& # 9E. & # 9permite que la enzima reconozca los sitios promotores.

5. & # 9 Marque qué afirmaciones son "Verdaderas" y cuáles son "Falsas" sobre la transcripción primaria en procariotas.

& # 9A. & # 9 Contiene un grupo trifosfato en su extremo 5 '.

B. & # 9 Contiene una secuencia rica en AU complementaria a la región -10 del molde de ADN. Esta parte del ADN no se transcribe.

C. & # 9A veces contiene información para más de una proteína. Por ejemplo, ARNm policistrónico

D. & # 9 A veces contiene una estructura de horquilla cerca de su extremo 3 '. Algunos ARNm terminan distalmente a tales estructuras en horquilla.

E. & # 9 Por lo general, contiene una secuencia poli A cerca de su extremo 3 '. Sin embargo, no se ha detectado poliA en muchos ARNm procarióticos y su posible importancia fisiológica se encuentra actualmente en evaluación.

RESPUESTA: A, C y D son verdaderas B y E son falsas, excepto que se indique lo contrario.

6. & # 9 Utilice las afirmaciones de la pregunta 5 para marcar aquellas que son falsas sobre la transcripción primaria en eucariotas.

RESPUESTAS: A = Verdadero B = Falso C = Falso (pocas excepciones) D = Falso (generalmente) E = Verdadero

REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN GENÉTICA

1. & # 9 Nombre varios procesos mediante los cuales el nivel de proteína puede regularse en la célula.

& # 9 a. & # 9 Replicación del ADN, que puede aumentar el número de genes de la proteína. Este tipo de regulación es importante para el crecimiento de virus. También se ve en casos de "amplificación de genes".

& # 9b. & # 9Transcripción. En particular, la regulación de la síntesis de ARNm a nivel de iniciación, es decir, como se enfatizó en la clase.

& # 9c. & # 9 Procesamiento de ARNm postranscripcional, incluida la conversión de ARNm que contiene intrón en ARN traducible en eucariotas. Además, degradación de ARNm, conversión de ARNm polisistrónico en ARNm cistrónicos individuales y otros eventos como "edición de ARN". Algunos de estos mecanismos se discutirán en otros cursos.

& # 9d. & # 9Traducción. La traducción, como la transcripción, puede regularse en los niveles de iniciación y alargamiento. Las proteínas de unión al ARN son un componente importante de los circuitos reguladores de genes en biología. Muchos ejemplos de regulación traslacional se discutirán en el curso del segundo semestre, Bioquímica 718.

& # 9e. & # 9 Modificación proteica postraduccional. El procesamiento de "poliproteínas" por proteasas, la escisión de proteínas (como la eliminación de péptidos "señal"), la fosforilación-desfosforilación, la acetilación y la adición de restos de carbohidratos y lípidos son algunos de los mecanismos que afectan la función y la estabilidad de los productos proteicos de los genes. .

2. & # 9 Dar ejemplos de factores genéticos que actúan en cis y en trans que controlan la transcripción.

cis-actuando: promotor, operador, silenciador, potenciador

de acción trans: ARN polimerasa, represor, proteína de unión TATA, TFIIB, CAP, triptófano.

Debería poder predecir los efectos de dichos factores.

3. & # 9 Explicar la regulación del operón lactosa de E. coli.

& # 9 Debería poder resumir los pasos involucrados en la activación y represión de este operón en respuesta al tipo de azúcar disponible como fuente de carbono para este organismo.

4. & # 9 Explica cómo los niveles de triptófano en una célula de E. coli regulan la biosíntesis de este aminoácido a través de la represión-desrepresión transcripcional y la atenuación del operón triptófano.

& # 9 Debería poder describir la regulación de este operón y contrastarla con la regulación del operón lactosa. ¿Es la atenuación un fenómeno de acción cis o trans?

5. & # 9 Explicar las funciones probables de (a) & # 9 surcos mayor y menor, (b) & # 9-grupos laterales de los pares de bases purina-pirimidina, y (c) la cadena principal de desoxirribosa fosfato del promotor en la unión de la E .coli ARN polimerasa (RNAP) holoenzima.


Materiales y métodos

Moscas y creación de mutantes

Las moscas se criaron a 25 ° C en medio de agar de harina de maíz estándar. Existencias que poseen PAG elemento y Minos las inserciones se obtuvieron del Bloomington Stock Center o del laboratorio de Hugo Bellen. En ciertas ocasiones, PAG los elementos fueron cruzados a un & # x003942 & # x020133 fuente de transposasa en un mus309 N1 antecedentes mutantes para generar grandes mutaciones por deleción, como se describe en [42]. los mus309 N1 la mutación se eliminó antes de la experimentación adicional.

Ensayos de sensibilidad a mutágenos

Para todas las pruebas, los mutantes heterocigotos se aparearon en viales que contenían 5 ml de alimento y se dejaron poner huevos durante tres días antes de transferirlos a viales nuevos durante dos días más. Un grupo de viales se trató con 250 & # x000b5L de solución de mutágeno, mientras que el otro se trató con el mismo volumen de control de vehículo. Para los estudios de radiación ionizante, los embriones se recolectaron en placas de agar de jugo de uva durante 12 horas y se dejaron desarrollar hasta larvas de tercer estadio, luego se irradiaron en un irradiador Gammator 1000. Para todos los demás mutágenos, la progenie se trató como larvas de primer estadio. El control del vehículo fue H20 para todos los tratamientos excepto para la camptotecina, en la que se utilizó DMSO en una solución de EtOH 20 & # x00025 Tween. El porcentaje de supervivencia en relación con el control se calculó como la proporción del porcentaje de homocigotos que eclosionaron en el grupo de tratamiento en relación con el número esperado basado en la supervivencia de homocigotos en el grupo de control. Cada experimento constaba de al menos cinco viales independientes y las barras de error representan desviaciones estándar de al menos tres réplicas independientes.

Reparación de huecos específicos del sitio Ensayo P

La reparación de la FC se controló a través del DSB creado después de la escisión de un Elemento P como se describió anteriormente ([43] y ver texto). Una segunda fuente de transposasa de cromosomas (CyO, H) fue utilizado para eliminar P para rev1 y pol eta mutantes individuales, mientras que todos los demás experimentos se realizaron con una tercera fuente de transposasa cromosómica (PAG ). Se realizaron controles de tipo salvaje emparejados usando la fuente de transposasa apropiada para cada experimento (el mismo control representativo para cada fuente de transposasa respectiva se indica a lo largo de todo). Los machos individuales que poseen ambos P y la fuente de transposasa se aparearon con hembras homocigotas para Los productos de reparación y P se recuperaron en la progenie femenina. Cada vial se contó como una muestra independiente y se calculó la significación estadística utilizando la prueba estadística de Mann-Whitney. Se recuperó el ADN genómico de moscas que poseían eventos de reparación independientes [44] y se llevó a cabo una PCR para estimar el alcance de la síntesis de reparación (ver Texto S1). Las longitudes del tracto de control se obtuvieron a partir de escisiones utilizando la tercera fuente de transposasa cromosómica.


Materiales y métodos

Cepas bacterianas y fagos

Las cepas bacterianas son E. coli Derivados de K12 y se enumeran en la Tabla. Se construyeron nuevos genotipos utilizando transducción estándar mediada por el fago P1 (Miller 1992). La presencia de recA, recG, ruvA, ruvB, y ruvC alelos fue confirmado por el aumento de fenotipos de sensibilidad a la luz ultravioleta. Para ruv recG mutantes dobles, se verificó una extrema sensibilidad a los rayos UV (Lloyd 1991). SMR650 se construyó a partir de SMR632 por transducción de ruvC53 eda-51::Tennesse10 (Lloyd 1991) de CS85, luego recG258::Tennesse10minikan de RDK2655 (Lloyd y Buckman 1991, obtenido de R. Kolodner). SMR3124 se construyó de manera similar [RDK2641 donóruvA59::Tennesse10 (Shurvinton y col. 1984)]. SMR632 transducido con P1 de SMR540 (colección de laboratorio, alelo de R. Maurer, Universidad Case Western Reserve, Cleveland, OH) produjo SMR4594. SMR4600 es SMR4594 con ruvC53 eda-51::Tennesse10 (Lloyd y Buckman 1991) y recG258::Tennesse10minikan (Lloyd y Buckman 1991). SMR4601 se preparó a partir de SMR4594 con P1 cultivado en SMR624 (Harris et al. 1994).

SMR3731 se preparó mediante la lisogenización de SMR632 con λJts15 rojo3 gam210 Δnin5 Sam7 [λSR459 (Sawitzke y Stahl 1997)], seguido de transducción a resistencia a kanamicina con P1 cultivado en un grpD55 malF::Tennesse10::kan cepa (Bull y Hayes 1996). SMR3732 se hizo a partir de SMR3731 transduciendo ruvC53 eda57::Tennesse10::leva (obtenido de un transductante de CS85 × P1 RM5258) y recG162 zib-636::Tennesse10(Storm et al. 1971).

Los fagos λ son de la colección λSR o fueron obsequios de F.W. Stahl (Universidad de Oregon, Eugene) o S. Hayes (Universidad de Saskatchewan, Saskatoon, Canadá). Los genotipos de fagos usados ​​en cruces para medir la frecuencia de recombinantes (Figs. Y) son de Razavy et al. (1996) y λΔb2 rojo3 gam210 cI857 Sam7(nin +) λbio1 (nin +). Los fagos utilizados en la Figura fueron λSR27, bio1 Δnin5, y en la Figura fueron MMS1816, λJts15 int4 rojo3 gam210 cI857 Δnin5 MMS1817, λint4 red3 gam210 Δnin5 Sam7y profago homoinmune MMS2076, λJts15 rojo3 gam210 Δnin5 Sam7, con funciones de empaquetado auxiliares proporcionadas por MMS2084, λJts15 int4 rojo3 gam210 imm 434 Δnin5 Sam7 (Sawitzke y Stahl 1997).

Crecimiento de stocks de fagos y E. coli culturas

dnaEts las cepas se cultivaron a 28 ° C. ruv recGlos mutantes dobles son de crecimiento lento y forman colonias pequeñas, de modo que los cultivos son propensos a la acumulación de colonias mutantes más grandes y de crecimiento más rápido que llevan mutaciones supresoras así como verdaderas reversiones (Lloyd y Buckman 1991 Harris et al. 1996). ruv recG Se cultivaron cepas dobles mutantes a 32 ° C para evitar la acumulación de supresores normalmente asociados con el crecimiento de estas cepas a temperaturas más altas (Harris et al. 1996). Se confirmaron los fenotipos UV y de sensibilidad al fármaco de todas las cepas para los cultivos usados ​​en cada experimento (y / o para aproximadamente 30 colonias de un cultivo dado). Los cultivos también se controlaron de forma rutinaria para detectar una posible acumulación de supresores o revertientes como se describió anteriormente (Harris et al. 1996).

Se cultivaron reservas de fagos λ (que llevan isótopos ligeros) y se realizaron ensayos de placa de acuerdo con procedimientos estándar (Murray 1983). Se cultivaron reservas de densidad de fagos λ marcadas con 13 C y 15 N de acuerdo con los procedimientos de Stahl et al. (1972) en bacterias prototróficas durante 12 a 14 horas a 32 ° C.

Ensayos de recombinación

Los experimentos en las figuras se realizaron como anteriormente (Razavy et al. 1996), excepto que los cultivos para infecciones mixtas se cultivaron a 32 ° C, inoculados a partir de 10-30 μl de los cultivos bacterianos congelados.

Ensayo de recombinación λ en ausencia de replicación del ADN

Λ precalentado, con etiqueta de densidad rojo gam nin(λSR27) se infectaron en SMR4594, 4600 y 4601 precalentados (a 43,5 ° C, moi = 10) que se habían cultivado a 28 ° C a 2 x 108 células / ml en caldo de triptona + extracto de levadura al 1%, 0,2% maltosa y 0,01 mg / ml de vitamina B1 (+25 μg / ml de kanamicina para ruv recGcepas, para evitar la acumulación de recG revertientes formados por escisión de transposón). Las células infectadas se burbujearon durante 30 min, se diluyeron con 4 ml de caldo precalentado (arriba), se burbujearon durante 35 min a 43,5 ° C, luego se lavaron con tampón TM frío (10 mm, Tris Mg), se resuspendieron en caldo frío (arriba), se lisaron con lisozima y cloroformo, se sedimentaron y se recogieron los sobrenadantes. Se recogió un gradiente de densidad preparado para cada lisado (McMilin y Russo 1972) como fracciones de dos gotas en 1 ml de TB y se tituló en SMR423.

Ensayo de recombinantes λ central y final formados bajo bloque de replicación parcial

El bloqueo parcial de la replicación se logró mediante la represión homoinmune y la infección por fagos auxiliares heteroinmunes, como lo describen Sawitzke y Stahl (1997), excepto que nuestro E. coli cepas también llevaron el grpD55 mutación.grpD55 codifica una helicasa DnaB que no interactúa con las proteínas de replicación λ (Bull y Hayes 1996). En ausencia de este alelo, la replicación de λ no podría bloquearse suficientemente enruv recG cepas para permitir la resolución de cualquier fago no replicado (picos de HH). Los recombinantes se ensayaron en las cepas JAS36 y JAS38 como se describe (Sawitzke y Stahl 1997).


Discusión

Identification of a poxvirus-encoded primase (22) suggested that poxviruses might also encode an endonuclease that would remove RNA primers in nascent DNA. The G5 protein seemed a likely candidate as it belongs to the FEN1 nuclease family (9, 10), some members of which are flap endonucleases (11). We isolated a VACV G5R deletion mutant and found that it was defective, generating only 2–4 infectious units per cell. Isolation of a revertant virus and transcomplementation with plasmid encoding the wt G5R gene confirmed that the replication defect was specific. Moreover, mutations of predicted catalytic aspartates abrogated complementation, strongly suggesting that G5 functions as a nuclease in DNA replication. Although the level of DNA replication determined by qPCR appeared unaffected, pulsed-field gel electrophoresis showed that the viral DNA made in the absence of G5 was a mixture of fragments, with a mean of about 45 kb instead of 200-kb, full-length genomes. The DNA fragments were double-stranded and representative of the entire genome because digestion with restriction endonucleases yielded the expected pattern. Furthermore, there was an excess of mature DNA termini compared to junctions, indicating that junction resolution had occurred. The presence of numerous random nicks in the DNA or accumulation of Okazaki-size fragments was ruled out by alkaline gel electrophoresis. Therefore, it seems most likely that the subgenomic DNA fragments result from DSBs, which occur in many systems at the replication fork, and that these DSBs are not repaired in the absence of G5. Assuming that the DSBs were random (i.e., Poisson-distributed) and that the mean fragment length was 45 kb, then full-length (185 kb) genomes would be expected to comprise approximately 1% of the total viral DNA. This estimated fraction of intact genomes is compatible with the observed residual infectivity of vΔG5.

Using a quantitative plasmid recombination assay developed by the Evans laboratory (20), we found that HR was diminished by 3- to 5-fold. In a second HR DSBR assay, we found a 7- to 8-fold decrease in cells infected with the G5R deletion mutant. The deficiencies in DSBR and HR are likely to have the same mechanistic cause as the two processes are intimately related (23). In eukaryotic cells, HR-mediated DSBR involves the resection of DNA ends to produce recombinogenic 3′ single-stranded tails. This process involves multiple nucleases including Mre11, a 3′-5′ exonuclease, and Exo1, a 5′-3′ exonuclease and flap endonuclease (23). An important next step will be to characterize the putative nuclease activity of G5. Recently Gammon and Evans (21) reported that the 3′ exonuclease of VACV DNA polymerase has a role in genetic recombination. In addition, the VACV Holliday junction resolvase can cleave a variety of branched DNA structures in vitro (4, 24, 25), although it is expressed late in infection whereas G5 and the viral DNA polymerase are expressed early. Thus, two or three nucleases are potentially involved in poxvirus DSBR and HR.

Most of the DNA made in cells infected with the G5 deletion mutant was not packaged in virus particles, even though junctions were resolved to form mature termini. There might be a length requirement for packaging DNA or mature termini might be required at both ends of the genome. Still another possibility is that G5 itself is required, since it is normally present in virus cores (13). At least two other proteins are needed for packaging DNA, namely a putative ATPase encoded by the A32 gene (14) and the telomere-binding protein I6 (15). The absence of DNA probably accounted for the spherical shape of the virions because similar-shaped virions have also been found with the A32 and I6 mutants.

The herpesvirus FEN1-family member is a ribonuclease involved in host and early viral mRNA degradation (26). To determine whether G5 also possessed such an activity, we compared the steady state levels of a cellular mRNA, an early VACV mRNA and an intermediate VACV mRNA in cells infected with wt VACV and the G5 deletion mutant. No differences were found suggesting that G5 does not affect mRNA stability. This result was not surprising given that VACV and other poxviruses encode decapping enzymes, which regulate mRNA half-life (27, 28). Other nucleocytoplasmic large DNA viruses including iridoviruses, ascoviruses, mimivirus, and one of the phycodnaviruses (but not other phycodnaviruses or African Swine Fever virus) encode predicted Fen1-family nucleases. However, these proteins are no more closely related to poxvirus G5 orthologs than they are to the herpesvirus homologs, leaving the roles of these proteins in viral reproduction an open question.


Discusión

Realized recombination analyzed by nucleotide sequence data depends both on the mechanisms that transfer DNA from genome to genome and the selective forces that act on the recombined sequence. Conjugation can lead to transfer of hundreds of thousands of bases from cell to cell in a single event ( Dale and Park 2010 Bellanger et al. 2014) but requires the presence of conjugation machinery in the donor cell. Natural transformation can lead to transfer of long DNA fragments up to dozens of kilobases including transposons, integrons, and/or gene cassettes ( Domingues et al. 2012). Natural transformation of naked DNA or transfer through phage allows shorter sequence to be incorporated into a cell and furthermore, DNA is often fragmented and partially digested before integration into the recipient genome. Imported DNA is more likely to persist if it confers novel function to a lineage or replaces deleterious mutations, but long imports are also more likely to disrupt existing functional interactions.

Comparative analysis revealed similarities and differences in the chromosomal pattern of recombination of ten human pathogens. The topography of the recombination landscapes differed, even for closely related species. Several species have recombination hot regions that were typically only a few hundred bases, for example, S. enterica. Its sister species, E. coli has hot regions that are more than 100 kb in length. There are other species, such as N. meningitidis, where hot regions are typically a few kilobases in length. Where there is high frequency of imports that span the same set of multiple genes, such as in E. coli, it is likely to reflect both opportunities for transfer of large stretches of DNA and the functional interaction of contiguous genes. Such long imports could potentially confer more advantage than short ones, if functional interactions of the imported continuous genes were preserved.

The link between frequent recombination in certain genes and bacterial invasion and colonization of the host tissue was shown in several species however in E. coli, there is also evidence for two very long hot regions. The degree of hotness varies within the long regions, implying that most of the events do not span the whole region. It is nevertheless likely that the recombination events responsible for the signal are substantially longer than those that underlie the short hotspots.

Across the ten species there was no evidence that gene boundaries determine the ends of recombination hot regions. For example, in N. meningitidis, tpbB, encoding the transferrin-binding protein, is hot due to strong natural selection for new variants during epidemics, but the boundaries of the import events are often several kilobases away from the gene ( Linz et al. 2000), leading to a hot region with indistinct edges.

The ten species in this study included three pairs that were relatively closely related, including E. coli y S. enterica. The other two pairs (from the genera Neisseria y Streptoccocus) did not show pronounced differences in the lengths of their hot regions. The correlation between orthologous genes was nevertheless relatively weak in the two Estreptococo species and moderate between N. meningitidis y N. gonorrhoeae. Our results therefore demonstrate that recombination hotspots and other quantitative features can change rapidly in bacteria as in mammals ( Auton et al. 2012). Such a change might reflect the divergence of the species’ ecological niches and their associated selective pressures.

There was a strong positive correlation between diversity and estimated recombination. As discussed previously ( Yahara et al. 2014), this correlation is difficult to interpret in a causal way. Our method can be more sensitive in detecting recombination where diversity is higher. Both realized recombination rates and the rate of substitution are increased by diversifying selection at particular loci. Furthermore recombination can also directly affect the amount of diversity that is observed, for example, by introducing diversity from distant taxa. Finally, sequence diversity can alter the amount of recombination that takes place due to mechanistic factors such as the suppression of recombination between divergent sequences by mismatch repair mechanisms ( Tham et al. 2013).

Parts of the mobile accessory genome can have a different GC content than the rest of the genome. However, the effect of GC content has not been related to homologous recombination in bacteria. Individual species did have significant but weak correlations between GC content and recombination but overall, we found no evidence that high or low GC regions are more likely to be transferred between genomes. Specific recombination processes such as transformation might be affected by GC content of the DNA that is being transferred, but these mechanistic factors are not consistent enough between species to leave a systematic signal in our scan. Nor did we find systematic patterns relating to other chromosomal features such as distance to origin of replication.

A feature that was consistent across all the ten species was the relationship to gene function. Ribosomal genes were, on average, recombination cold in every species and were colder than expected based on their low nucleotide diversity. These genes were conserved across species because of their central role in cellular replication and are assumed to be principally under purifying selection. Genes encoding other cellular housekeeping functions were also cold. These genes can be contrasted with the categories of genes encoding surface structures, membranes, lipoproteins and porins, and the cell envelope, all of which involve the interaction of the cell with its environment and each of which was recombination hot. This interaction has often been presumed to lead to species specific and fluctuating selection pressures. Our findings suggest that the contrast between housekeeping and cell surface function does indeed lead to a substantial difference in realized recombination rates.

Most human pathogens have emerged from harmless commensal organisms. The rapid evolution of virulence traits may be facilitated by high rates of recombination, in which case virulence genes would be expected to give a recombination hot signal. This was observed in E. coli however, no consistent signal was observed across the ten species. One explanation for this is that annotation of virulence genes is not adequate, or virulence is a composite term incorporating transmission efficacy, toxin production, and other factors associated with pathogenic human infection. The genes associated with these traits may evolve in very different ways. In other words, the signature of higher realized recombination rate can be useful to detect various traits under positive selection. Using techniques, such as that employed here, it will be possible to investigate broad patterns in the localization of recombination and the mechanistic and selective features involved.


una. The leading strand is synthesized in the same direction as the movement of the replication fork, whereas the lagging strand is synthesized in the opposite direction

B. the lagging strand is synthesized continuously, whereas the leading strand is synthesized in short fragments that are ultimately stitched together

C. the leading strand is synthesized by adding nucleotides to the 3' end of the growing strand, whereas the lagging strand is synthesized by adding nucleotides to the 5' end

D. none of the above - leading and lagging are just terms to differentiate the top from the bottom strand


Ver el vídeo: BIOLOGÍA II TEMA: RECOMBINACIÓN DEL ADN EN LA NATURALEZA (Mayo 2022).