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Una pregunta sobre ImageQuantTL

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Me confunde el uso de la aplicación ImageQuantTL como herramienta para analizar el gel de urea. Mi problema es que no estoy seguro de si la 'forma' para el cálculo debería ser la misma para todas las muestras (como en la imagen A) o lo más cerca posible de la banda (como en la imagen B). ¿Y qué pasa con la resta de fondo? La opción 'Imagen Rectángulo / Elipse' dice:

Utiliza la intensidad de píxel promedio en un área rectangular o elíptica definida de la imagen. Para definir el área para el cálculo del fondo, seleccione la forma del fondo en el navegador y luego arrastre con el mouse. Las áreas de fondo se identifican por un borde de color roto y se numeran en la secuencia en la que se crean. Si ha definido varias áreas de fondo, seleccione el área a usar en la pestaña Parámetros.

¿Significa que la forma de la resta de fondo no tiene que ser necesariamente del mismo tamaño que la forma de la banda? (Ver Figura C.) Adjunto algunas fotografías para su conveniencia.

Muchas gracias por cualquier ayuda.


Definitivamente optaría por la opción A. Si está asumiendo que la tinción en la banda 6 se debe a lo que sea que esté midiendo, no hay razón para pensar que la señal en la parte superior del carril 1 no sea significativa.

Dicho esto, este tipo de medidas es solo semicuantitativo, por lo que ser demasiado "exigente" en la forma en que elige su región probablemente no aumentará la precisión de su resultado. Si desea obtener una medida cuantitativa, me temo que tendrá que recurrir a alguna otra técnica.

Finalmente, tenga en cuenta que el área obviamente significa mucho si está mirando la intensidad total de las bandas, en lugar de la intensidad promedio.


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Nuestro sitio web ofrece una descarga gratuita de ImageQuantTL 7.0. Max Payne 3 de 10 MB de alta compresión. 1. ControlCentre.exe o iq.exe son los nombres de archivo predeterminados para indicar el instalador de ImageQuantTL. Esta descarga fue verificada por nuestro antivirus integrado y calificada como limpia. ImageQuantTL se incluye en Herramientas educativas. La siguiente versión: 7.0 es la más descargada por los usuarios del programa. Este programa es propiedad intelectual de GE Healthcare. ImageQuant TL es el software de análisis de imágenes generales más potente, flexible y competitivo disponible para la comunidad biotecnológica.

Software para la cuantificación en gel de proteínas y ARN. Cuantificación de imágenes y proteínas, ARN. Descargue el software gratuito V 1.7.8 (. Gratis ahora y siempre lo será). ImageQuant Software PhIFI Core Facility Oficina de investigación y estudios de posgrado ECU Brody School of Medicine. La Informática Biomédica y la Administración de Investigación están trabajando juntas para proporcionar el software ImageQuant TL de GE Healthcare Life Sciences para el análisis de imágenes de investigación. Si tiene preguntas sobre el Typhoon, otros equipos de imágenes, la lista de usuarios o descargas de software, comuníquese con [email protected]

Está estructurado en torno a aplicaciones de uso frecuente y es una herramienta esencial en los laboratorios de ciencias biológicas modernos. Al proporcionar soporte para archivos multicanal, ImageQuant TL permite a los usuarios beneficiarse de la multiplexación fluorescente, lo que aumenta el rendimiento y la precisión. Quizás esté interesado en probar otros programas, como World Geography Tutor, Solmetric SunEye o FSAcars, que podrían ser ImageQuantTL. Proyecto Torrent Ms para Mac allí.


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El plasma a presión atmosférica no térmica proporciona una nueva oportunidad terapéutica para controlar los procesos basados ​​en redox, p.ej. cicatrización de heridas, cáncer y enfermedades inflamatorias. Mediante la entrega espacial y resuelta en el tiempo de especies reactivas de oxígeno y nitrógeno, permite la estimulación o inhibición de procesos celulares en sistemas biológicos. Nuestros datos muestran que la expresión de genes y proteínas se ve muy afectada por el plasma no térmico. Se descubrió que el factor 2 relacionado con el eritroide nuclear (NRF2) y los componentes de la vía enzimática de fase II actúan como controladores clave que orquestan la respuesta celular en los queratinocitos. Además, se vio afectado el metabolismo del glutatión, que es un marcador de eventos de señalización relacionados con NRF2. Entre los genes y proteínas más robustos, se encontraron hemo oxigenasa 1, NADPH-quinona oxidorreductasa 1 y factores de crecimiento. Los roles de los objetivos de NRF2, investigados por silenciamiento de ARNip, revelaron que NRF2 actúa como un interruptor importante para detectar eventos de estrés oxidativo. Además, la influencia del plasma no térmico en la vía NRF2 prepara a las células contra las noxas exógenas y aumenta su resiliencia contra las especies oxidativas. A través de mecanismos paracrinos, las células distantes se benefician de la comunicación célula-célula. El hallazgo de que el plasma no térmico desencadena procesos similares a la hormesis en los queratinocitos facilita la comprensión de la interacción plasma-tejido y su aplicación clínica.

Ambos autores hicieron contribuciones iguales a este trabajo.


Materiales y métodos

Cultivo de células.

Todas las líneas celulares se cultivaron en monocapa en placas de cultivo celular de poliestireno tratado (Corning) a 37 ° C en 3% de O2, 5% CO2y 97% de humedad relativa en incubadoras HERA Cell 240. Los fibroblastos humanos normales HCA2, IMR-90 y WI-38 usados ​​en este estudio se inmortalizaron por expresión constitutiva de hTERT a partir del retrovirus pBABE-Puro integrado. La línea de fibroblasto de prepucio humano inmortalizado HCA2 y el fibroblasto de pulmón embrionario inmortalizado IMR-90 y WI-38 se mantuvieron en MEM (ATCC) suplementado con FBS FBS al 15%, (Gibco) y 1 x Pen / Strep (Gibco). Las células epiteliales mamarias humanas normales HMEC1, HMEC2 y HMEC4 (Clonetics) se mantuvieron en MEBM (Lonza) y se suplementaron con MEGM SingleQuots (Lonza), que contiene BPE, hEGF, insulina, hidrocortisona y GA-1000. La línea celular de fibrosarcoma humano HT1080 (ATCC), la línea de riñón embrionario humano GP2-293 (Clontech) y la línea de carcinoma cervical humano HeLa (ATCC) se mantuvieron en DMEM (Gibco) complementado con FBS al 10% (Gibco), 1 × Pen / Strep (Gibco) y 1 × aminoácidos no esenciales (Gibco). La línea de carcinoma epitelial de mama MDA-MB-468 (ATCC) se mantuvo en Leibovitz L-15 (ATCC) suplementado con FBS al 10% y 1 × Pen / Strep. La línea de carcinoma epitelial de mama HCC-1954 (ATCC) se mantuvo en RPMI-1640 (ATCC) y se complementó con FBS al 10% y 1 × Pen / Strep. El carcinoma epitelial de mama T47-D (ATCC) se mantuvo en RPMI-1640 suplementado con FBS al 10%, 1 x Pen / Strep y 0,01 mg / ml de insulina bovina (Sigma I 4011). La línea de carcinoma epitelial de mama MCF7 (ATCC) se mantuvo en MEM y se complementó con FBS al 10%, 1 x Pen / Strep y 0,01 mg / ml de insulina bovina.

Clonación de la región promotora humana Rad51 y construcción de plásmidos pRad51-GFP, pRad51-Luc y pRad51-DTA.

La región reguladora de Rad51 de 6.532 pb se clonó en dos pasos. En el primer paso, la región de 2931 pb en sentido ascendente a 230 pb en sentido descendente desde el inicio de la transcripción se amplificó mediante PCR utilizando el kit de PCR rico en GC (Roche) con los cebadores 5′-AACATTAATGCACAGCAGGTGAGCAGCTAGCAAGCAAGC-3 ′ y 5′-CGCACCGGTGCCATTCCGTCC -GACTCGCCTC ', Y se subclonó en el plásmido pEGFP-N1 (Clontech) para reemplazar el promotor CMV original digiriendo tanto el producto de PCR como el plásmido con las enzimas de restricción AseI + AgeI dando como resultado el plásmido pRad51 (1/2). En el segundo paso, se utilizaron los cebadores 5′-TCTGTAAACTCGCGCAGGATCAAGCTCTCG-3 ′ y 5′-TCCACCGGTGTATCTGCATTTGCTTCAAGCTGCATCTGC-3 ′ para amplificar por PCR 164 pb en sentido ascendente a 3.601 pb en sentido descendente desde el sitio de inicio de la transcripción Rad51. Se utilizó un sitio EcoRI interno ubicado 23 pb corriente arriba del inicio de la transcripción y los sitios AgeI introducidos por oligo para digerir tanto el producto de PCR como el plásmido pRad51 (1/2), seguido de la ligadura del fragmento del gen Rad51 desde 2931 pb corriente arriba hasta 24 pb cadena arriba del inicio de la transcripción con el fragmento que contiene 23 pb cadena arriba hasta 3.601 pb cadena abajo del inicio de la transcripción. Este método de dos pasos reconstituye la región reguladora de Rad51 de longitud completa de 6.532 pb de tipo salvaje, que contiene 2.931 pb en sentido ascendente hasta 3.601 pb en sentido descendente desde el inicio de la transcripción. La región reguladora incluye el inicio de la transcripción, el primer exón (no codificante), el primer intrón y los primeros 40 pb del segundo exón (codificante), con el gen GFP ligado en marco después del segundo fragmento de exón de 40 pb. El plásmido pRad51-GFP final se ensayó mediante digestión y secuenciación con enzimas de restricción.

Para transferir la región promotora Rad51 completa de 6.532 pb al pGL3-Basic sin promotor (Promega), que contiene el gen de la luciferasa de luciérnaga, los sitios de las enzimas de restricción AgeI y AseI tuvieron que introducirse en el polienlazador pGL3-Basic mediante mutagénesis dirigida al sitio ( Stratagene) con los siguientes cebadores: 5'-CCGGAAGCTTACCGGTCGCCACCATGGAAGACGCC-3 'y 5'-GCCAAGCTTAATTAATTCGCAGATCTCGAGCC-3', dando como resultado el vector pGL3-Basic (Edad / Ase). A continuación, las enzimas de restricción AseI y AgeI cortaron la región promotora Rad51 de longitud completa del plásmido pRad51-GFP y se clonaron en los mismos sitios en pGL3-Basic para crear pRad51-Luc, con el inicio de la traducción del gen de luciferasa de luciérnaga en marco con los primeros 12 aminoácidos de la región codificante de Rad51 y bajo el promotor Rad51.

Para construir pRad51-DTA, que contiene el promotor Rad51 que controla el gen de la toxina A de la difteria bacteriana, se escindió GFP de pRad51-GFP con las enzimas de restricción AgeI y NotI y se reemplazó con el gen que codifica DTA. El gen DTA se obtuvo mediante PCR amplificando la secuencia codificante de DTA del plásmido pROSA26KPN (de P. Soriano, Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, WA) con los siguientes cebadores para introducir un sitio AgeI en el extremo 5 'y un sitio NotI en el extremo 3 ′: 5′TTAGCGGCCGCTTAGAGCTTTAAATCTCTGTAGGTAG-3 ′ y 5′-CCTACCGGTCGCCACCATGGATCCTGATGATGTTG-3 ′.

Western Blots.

Las células en crecimiento exponencial se recogieron y se contaron en un contador de partículas Beckman Coulter Z2. Las células se resuspendieron en PBS pH 7,4 (Gibco) con mezcla inhibidora de proteasa completa (Roche) y se lisaron mezclándolas con tampón de muestra Laemmli (BioRad) que contenía 2-mercaptoetanol al 5% (JTBaker), seguido de ebullición durante 10 min con agitación en vórtex cada 5 min. La concentración de proteína se determinó mediante ensayo de proteína DC (BioRad). Los extractos de proteínas (25 μg) de cada línea celular se separaron en un SDS / PAGE al 10%, se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (BioRad) y se bloquearon en TBS-T con leche en polvo al 1,25% (peso / volumen). Las membranas se sondaron con anticuerpos primarios monoclonales de ratón contra Rad51 humano (NeoMarkers) durante la noche o α-tubulina (Abcam) durante 2 h y se sondaron con anticuerpos secundarios de cabra anti-ratón conjugados con HRP (BioRad) durante 2 h. Las imágenes se analizaron utilizando ImageQuantTL (Amersham).

RT-PCR cuantitativa.

Las células en crecimiento exponencial se recolectaron y contaron en un contador de partículas Beckman Coulter Z2. El ARNm se extrajo utilizando el kit RNeasy Mini y QIAshredder (Qiagen) y las concentraciones se determinaron mediante espectrofotometría A260 nM en un SmartSpec Plus (BioRad). Se utilizó el kit Titan de RT-PCR de un tubo (Roche) para amplificar el 5 'de ARNm de Rad51 utilizando 0,4 μg de ARNm total y los cebadores 5'CCAGAGACCGAGCCCTAAGGAGAGTGCG-3' y 5'-TGGCATTTATGCCACACTGCTCTAACCGTG-3 '. Se utilizó el siguiente programa de PCR para cuantificar la transcripción principal: (1) calentar 0,4 μg de muestra de ARN en 16 μL de ddH2O a 85 ° C durante 3 min (2) agregue enzima / cebador / mezcla de dNTP (3) 50 ° C durante 30 min (4) 94 ° C durante 2 min (5) 10 ciclos de 94 ° C durante 1 min, 60 ° C durante 1 min, 68 ° C durante 1 min (6) 15 ciclos de 94 ° C durante 1 min, 60 ° C durante 1 min, 68 ° C durante 1 min + 5 seg / ciclo y (7) 68 ° C durante 7 min. Se ejecutó un programa de PCR similar para examinar la variante de empalme alternativa más pequeña en el extremo 5 ', con 5 ciclos adicionales en el paso 6. La PCR de control se realizó en las mismas condiciones que la reacción experimental con cebadores para la subunidad ribosómica 18S de los estándares internos QuantumRNA 18S kit (Ambion) a 3: 7 imprimación 18S: mezcla de competimer. Los productos de PCR se procesaron en un gel de agarosa al 1,5% y se analizaron mediante ImagequantTL (Amersham).

Actividad del promotor Rad51 y ensayos de luciferasa.

Se transfectaron dos microgramos de pRad51-Luc o 2 µg de pEGFP-N1 (Clontech) en 1 x 106 células en crecimiento de cada una de las 13 líneas celulares mediante electroporación Amaxa Nucleofector II. Se utilizaron los siguientes programas de nucleofectores y soluciones de transfección para cada línea celular: HCA2, programa U-20 y solución NHDF IMR-90, programa X-001 y solución NHDF WI-38, programa V-001 y solución NHDF HMEC1, HMEC2 y HMEC4, programa Y-001 y solución HMEC MDA-MB-468, programa X-005 y solución V HT1080, programa L-005 y solución V GP2–293, programa A-023 y solución V HCC1954, programa A-023 y solución V T47-D, programa A-023 y solución V MCF7, programa P-020 y solución V y HeLa, programa I-013 y solución V. Las células transfectadas con pEGFP-N1 se recolectaron 72 h después de la transfección y se analizaron mediante análisis FACS para determinar el porcentaje de células con GFP detectable. Las células transfectadas con pRad51-Luc se recolectaron y contaron 72 h después de la transfección y se lisaron usando tampón de lisis pasivo (Promega) en una proporción de 200 μL / 1 × 10 6 células y luego se usaron 20 μL de este extracto en el ensayo de luciferasa (Promega). utilizando un luminómetro GloMax20 / 20 (Promega).

Análisis del efecto del DTA impulsado por el promotor Rad51 en las células: recuento celular y ensayo de luciferasa.

Las células se dividieron y, 24 h después, se cotransfectaron 1 x 105 células de cada línea celular con 0, 0,01, 0,02, 0,04, 0,08 o 0,1 μg de pRad51-DTA suplementado con el plásmido básico pGL3 de control para obtener la cantidad de ADN. a 0,1 μg en cada transfección, junto con 1 μg de plásmido de control de pGL3 que contiene luciferasa de luciérnaga bajo el promotor SV40 utilizando un reactivo de transfección Fugene 6 (Roche). Las células se recolectaron 72 h después de la transfección y se contaron mediante un contador de partículas Z2 (Beckman Coulter), y se obtuvieron extractos de proteínas mediante lisis de células con tampón de lisis pasivo (Promega) en una proporción de 50 μL / 50.000 células. Se usaron veinte microlitros del extracto para cada ensayo de luciferasa.

Para medir la supervivencia celular después de la transfección pRad51-DTA (Fig.3B) es fundamental calcular la supervivencia de transfectado células, porque el recuento total de células obtenido 3 días después de la transfección con pRad51-DTA incluye células no transfectadas que continúan proliferando, mientras que las células muertas por DTA no proliferan. Para calcular el porcentaje de supervivencia de las células transfectadas (ST) usamos la fórmula: donde TSE es el número de células transfectadas (células que recibieron el plásmido) que sobrevivieron después de la transfección con pRad51-DTA, y TCAROLINA DEL SUR es el número de células transfectadas que sobrevivieron después de la transfección de control con el vector GFP. TSE y TCAROLINA DEL SUR se calculan como: donde H es el número total de células recolectadas 3 días después de la transfección, k es la tasa de crecimiento de las células no transfectadas, calculada como el número de células recolectadas 3 días después de la transfección de control (GFP) dividido por el número de células en placa. norte es el número de células que no recibieron el plásmido, calculado como el número total de células utilizadas para la transfección multiplicado por la eficacia de la transfección.

El experimento que mide la disminución de la actividad luciferasa después de la transfección pRad51-DTA en relación con la transfección de control (Fig.3C) no requirió una corrección para la eficiencia de la transfección. Esto se debe a que solo las células transfectadas expresaban luciferasa.


Discusión

En este estudio, describimos la capacidad de la proteína CHD7 recombinante para funcionar como un remodelador de nucleosomas dependiente de ATP. Mostramos que muchas mutaciones involucradas en los síndromes del desarrollo humano impactan en la función de remodelación de la cromatina de CHD7, vinculando así una función conocida por ser importante para la regulación genética de estas patologías humanas.

Las proteínas de remodelación de nucleosomas dependientes de ATP se encuentran en varias clases que muestran importantes distinciones funcionales en la forma en que hacen que el ADN sea accesible a las proteínas reguladoras. Encontramos que CHD7 difiere de hSWI / SNF ya que requiere mononucleosomas con una proyección de ADN superior a 40 pb para una remodelación eficiente (Fig.2 A y B). Es posible que CHD7 in vivo no sea capaz de remodelar eficientemente nucleosomas empaquetados, mientras que hSWI / SNF sí. Alternativamente, la unión de un factor al ADN cerca de un nucleosoma podría interferir con CHD7 pero no con la remodelación de hSWI / SNF. Una segunda diferencia importante es que CHD7 desliza nucleosomas de manera diferente que hSWI / SNF (Fig.1D) y esto también podría afectar la función biológica. El comportamiento de CHD7 con respecto a la longitud y el deslizamiento del conector de ADN es similar al de los remodeladores que pueden espaciar nucleosomas, lo que sugiere que este podría ser un papel que juega CHD7 durante la regulación de la expresión génica. Estas distinciones funcionales podrían explicar en parte por qué, aunque la besos gen y varios Drosophila Las subunidades del complejo SWI / SNF se clasificaron funcionalmente en el mismo TrxG de genes, los embriones requieren ambas actividades de remodelación para ejecutar correctamente los programas de desarrollo. Además, nuestros datos proporcionan una posible justificación bioquímica de por qué estas clases de remodeladores colocalizan extensamente en Drosophila (59) y en células madre embrionarias de ratón (9).

CHD7 contiene un módulo SANT-SLIDE, que se encuentra en varias proteínas remodeladoras, incluidas las proteínas ISWI y CHD. Se ha propuesto que este módulo se una al ADN extranucleosomal (53) y lo “bombee” hacia el octámero de histonas (41). Aunque el dominio SLIDE putativo se encuentra cadena arriba del dominio SANT en la secuencia primaria de CHD7, se predice que se pliegue de manera similar (53). Nuestro análisis indica que CHD7 usa el SANT-SLIDE para remodelar eficientemente los nucleosomas porque su deleción causa una reducción significativa en la actividad de remodelación de los nucleosomas (Fig. 3). Esto indica que los pacientes con mutaciones en CHD7 que causan la pérdida de la región C-terminal que contiene el dominio SLIDE probablemente tendrán niveles de remodelación de CHD7 similares a los de los pacientes heterocigotos nulos.

La mayoría de las mutaciones (∼80%) identificadas en pacientes con CHARGE crean cambios de marco o introducen un codón de parada prematuro en el CHD7 secuencia. De 528 mutaciones enumeradas por Jansen et al., Al menos 250 eliminarían regiones cadena arriba del aminoácido 1899 si los ARNm mutantes fueran traducidos, y se podría predecir que esto perjudicaría gravemente la remodelación por CHD7 (47). Las mutaciones puntuales sin sentido son una clase más pequeña (~ 8%) en los pacientes con CHARGE. Analizamos tres de estas mutaciones y encontramos un rango de impacto en la actividad de CHD7, a pesar de la ocurrencia de estas mutaciones en residuos altamente conservados. Es posible que las condiciones in vitro utilizadas no evaluaran el impacto total sobre la remodelación que estas mutaciones mostrarían in vivo. Además, se prevé que algunas mutaciones pueden no afectar la actividad de CHD7, sino que interrumpen importantes interacciones proteína-proteína. Es de destacar que se han identificado dos variantes de corte y empalme de CHD7 que codifican polipéptidos que carecen del dominio ATPasa (y otras regiones) (60, 61). Estas variantes podrían desempeñar funciones biológicas clave que son independientes del ATP; el impacto de las mutaciones en estas isoformas de proteínas aún no se ha determinado.

En conclusión, hemos demostrado que CHD7 es una proteína remodeladora de nucleosomas con un conjunto distinto de características. El análisis de mutantes CHD7 sugiere que la haploinsuficiencia es una explicación probable de la patogenicidad de aproximadamente 250 mutaciones de pacientes CHARGE. Estos análisis permiten una base para predecir el impacto de nuevas mutaciones de pacientes humanos en la actividad de remodelación de CHD7 y para estudios que evalúan el impacto de estas mutaciones en líneas celulares derivadas de estos pacientes.


Materiales y métodos

Cepas y plásmidos

Las cepas de levadura y los plásmidos utilizados en este estudio se enumeran en las Tablas S1 y S2 del Apéndice. Los plásmidos dPSTR se transformaron en una cepa de levadura de un fondo W303 MATa, que lleva un marcador Hta2-CFP (ySP580).

Cada dPSTR es transportado completamente por un único vector de integración (pSIV Wosika et al, 2016) e integrado en el genoma. Las variantes roja (y amarilla) del dPSTR (dPSTR R y dPSTR Y, respectivamente) están integradas en el URA3 (resp. LEU2) locus y basado en la interacción de SynZips SZ1 – SZ2 (resp. SZ3 – SZ4) (Thompson et al, 2012), y la variante fluorescente mCherry (resp. MCitrine) (Aymoz et al, 2016). Los promotores relevantes de interés (típicamente -1.000 a -1) se amplificaron y clonaron corriente arriba de la parte estable inducible de dPSTR, en pSP360 para dPSTR R y pSP363 para dPSTR Y, y se verificaron mediante secuenciación. A continuación, la parte inducible se clonó adicionalmente en el vector pSIV que contenía la parte FP del dPSTR (pDA157 para el dPSTR R y pDA223 para el dPSTR Y).

Para las variantes del promotor sintético (Fig. 3 y Fig. S16 del apéndice), una versión sintética de pFIGURA 1 o pAGA1 fue diseñado, que contiene sitios de restricción únicos (ApaI y ClaI) que rodean la región que contiene los PRE. Esto permitió obtener plásmidos dSPTR de mutantes de cada promotor en una sola clonación (Tabla S2 del Apéndice). Fragmentos modificados de pFIGURA 1 y PAGA1 con mutaciones secuenciales de PRE en sitios de restricción NdeI (CATATG) o SnaBI (TACGTA) fueron diseñados y sintetizados por IDT (gBlocks), y clonados en pDA283 o pDA282 usando ApaI-ClaI. Todas las construcciones se verificaron mediante digestión y secuenciación. La variante del promotor integrado se amplificó a partir de ADN genómico y se secuenció para su confirmación. También verificamos que la presencia de los sitios de clonación Apayo y ClaNo estaba alterando la inducción de los dos promotores (datos no mostrados).

Para cuantificar la actividad quinasa, los plásmidos SKARS se transformaron en una cepa que lleva pFIGURA 1- o pAGA1-dPSTR R (Durandau et al, 2015 ).

Para cada transformación, se seleccionaron ocho clones en función de sus intensidades de fluorescencia y se analizaron más cuatro clones con niveles de fluorescencia similares mediante un experimento de lapso de tiempo tras la estimulación con 1 μM de factor α, para descartar los clones que mostrarían un comportamiento de reubicación aberrante.

Preparación de la muestra

Las células se cultivaron durante la noche en medio sintético selectivo hasta la saturación (YNB: CYN3801, CSM: DCS0031, ForMedium). Fueron diluidos a una DO600 de 0,05 por la mañana y se cultivó durante 4 h antes de iniciar el experimento. Todos los experimentos de lapso de tiempo se realizaron en portaobjetos de pocillos, para los cuales se recubrieron pocillos seleccionados de placas de 96 pocillos (MGB096-1-2LG, Matrical Bioscience) con solución filtrada de concanavalina A en H2O (0,5 mg / ml, C2010-250MG, Sigma-Aldrich) durante 30 min, enjuagado con H2O, y se seca durante al menos 10 h. Antes de los experimentos, las células se diluyeron a una DO600 de 0,04 y se sonicó brevemente, y se añadieron a un pocillo 200 µl de suspensión celular. La formación de imágenes se inició 30 minutos más tarde, para dejar que las células se depositaran en el fondo del pozo. Para estimular las células, se añadieron al pocillo 100 µl de una solución 3 µM de factor α exógeno sintético (obsequio del laboratorio de M. Peter) para alcanzar una concentración final de feromona de 1 µM.

Microscopía

Las imágenes se adquirieron en un microscopio de epi-fluorescencia invertido totalmente automatizado (Ti-Eclipse, Nikon) controlado por Micro-Manager (Edelstein et al, 2010) y se coloca en una cámara de incubación a 30 ° C, con un objetivo de aceite 40X y filtros de excitación y emisión adecuados. La excitación fue proporcionada por una fuente de luz de estado sólido (SpectraX, Lumencor). Las imágenes se grabaron con una cámara sCMOS (Flash4.0, Hamamatsu). Una etapa XY motorizada permitió registrar múltiples campos de visión en cada punto de tiempo, típicamente cinco posiciones por pozo y ocho pozos por experimento. Se registraron CFP (50 ms), RFP (300 ms) e YFP (300 ms) y dos imágenes de campo claro (10 ms) a intervalos de tiempo de 2 minutos antes de la inducción y 5 minutos después.

Análisis de los datos

Las películas de lapso de tiempo se analizaron con la plataforma YeastQuant (Pelet et al, 2012). Brevemente, los núcleos de las células se segmentaron por umbralización de las imágenes de CFP. El contorno de la célula alrededor de cada núcleo se detectó mediante dos imágenes de campo claro. El objeto de citoplasma se obtuvo eliminando el objeto núcleo expandido en dos píxeles del objeto celular. Se escribieron scripts dedicados en Matlab (The Mathworks) para analizar más los datos. Solo se tomaron en consideración las celdas rastreadas desde el principio hasta el final de la película. Además, se aplicó un control de calidad en cada traza y solo las células con baja variabilidad en el área nuclear y celular, fluorescencia de CFP nuclear y una relación de fluorescencia de RFP a YFP menor que un cierto umbral se mantuvieron para análisis posteriores. Se cuantificaron al menos 100 células, pero a menudo entre 200 y 300 células, para cada réplica. Las curvas mostradas en las figuras son de un experimento representativo de al menos tres réplicas biológicas. El cuadro S3 del apéndice resume el número de células cuantificadas en cada panel de figuras. Los valores de enriquecimiento nuclear para todas las trazas unicelulares utilizadas para generar las cifras principales se proporcionan en el conjunto de datos EV1.

Para cada célula, se calculó la diferencia entre su intensidad media en el núcleo y el citoplasma en cada punto de tiempo para representar el enriquecimiento nuclear de dPSTR R y dPSTR Y.

Para un análisis más detallado, todas las trazas de células retenidas se suavizaron mediante una media móvil de tres puntos. El nivel basal se calculó como la media de los tres puntos de tiempo que preceden a la estimulación. El enriquecimiento nuclear corregido del dPSTR se calculó restando el nivel basal a la traza suavizada. La salida de expresión representa el enriquecimiento nuclear corregido máximo del dPSTR. La salida de expresión promediada por población se calculó sobre la traza media de todas las células. Un umbral para calificar las células como expresivas se definió como el 20% de la producción de expresión promediada por la población. Para todas las células que expresan, las trazas de dPSTR se normalizaron entre 0 y 1, y el tiempo de respuesta se identificó como el primer punto de tiempo, después de la estimulación, en superar 0,2. Para los gráficos de correlación promedio de población y correlaciones instantáneas, todos los trazos de células se normalizaron por el trazo medio de todas las células.

Ensayos de chips

Los cultivos de levadura se cultivaron hasta la fase logarítmica temprana (A660 0,4-0,6), y luego, las muestras (50 ml) se sometieron a factor α 1 µM durante los tiempos indicados. Para la reticulación, las células de levadura se trataron con formaldehído al 1% durante 20 min a temperatura ambiente. Se añadió glicina hasta una concentración final de 330 mM durante 15 min. Las células se recogieron, se lavaron cuatro veces con TBS frío (Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM) y se mantuvieron a -20 ° C para su posterior procesamiento. Los sedimentos celulares se resuspendieron en 0,3 ml de tampón de lisis frío (HEPES-KOH 50 mM, pH 7,5, NaCl 140 mM, EDTA 1 mM, desoxicolato de sodio al 0,1%, Triton X-100 al 1%, PMSF 1 mM, benzamidina 2 mM, 2 μg / ml de leupeptina, 2 μg / ml de pepstatina, 2 μg / ml de aprotinina). Se añadió un volumen igual de perlas de vidrio y las células se rompieron agitando en vórtex (con Vortex Genie) durante 13 min en hielo. Las perlas de vidrio se descartaron y la cromatina reticulada se sometió a ultrasonidos con un sonicador de baño de agua (Bioruptor) para producir un tamaño de fragmento de ADN promedio de 350 pb (rango, 100-850 pb). Finalmente, las muestras se clarificaron mediante centrifugación a 16.000 gramo durante 5 min a 4ºC. Los sobrenadantes se incubaron con 50 µl de anticuerpos monoclonales anti-HA 12CA5 o anti-Myc 9E10 acoplados previamente a IgG DynabeadsTM de ratón pan (Invitrogen, 11042). Después de 120 min a 4 ° C en un rotador, las perlas se lavaron dos veces durante 4 min en 1 ml de tampón de lisis, dos veces en 1 ml de tampón de lisis con NaCl 500 mM, dos veces en 1 ml de tampón de lavado (Tris-HCl 10 mM pH 8.0, LiCl 0,25 M, EDTA 1 mM, NP-40 al 0,5%, desoxicolato de sodio al 0,5%) y una vez en 1 ml de TE (Tris-HCl 10 mM pH 8,0, EDTA 1 mM). El material inmunoprecipitado se eluyó dos veces de las perlas calentando durante 10 min a 65 ° C en 50 μl de tampón de elución (Tris-HCl 25 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM, SDS al 0,5%). Para revertir la reticulación, las muestras se ajustaron a 0,3 ml con tampón de elución y se incubaron durante la noche a 65ºC. Las proteínas se digirieron añadiendo 0,5 mg / ml de proteinasa K (Novagen, 71049) durante 1,5 ha 37ºC. El ADN se extrajo con fenol-cloroformo-alcohol isoamílico (25: 24: 1) y cloroformo. Finalmente se precipitó con 48% (v / v) de isopropanol y NaCl 90 mM durante 2 ha -20 ° C en presencia de 20 μg de glucógeno y se resuspendió en 30 μl de tampón TE. Análisis cuantitativo de PCR de AGA1 y FIGURA 1 Las secuencias promotoras utilizaron los siguientes cebadores con ubicaciones indicadas por la distancia del codón de iniciación ATG respectivo: AGA1 promotor (−310 / −207) FIGURA 1 promotor (-400 / -197) y TEL (región telomérica en el brazo derecho del cromosoma VI). Se realizaron experimentos con tres preparaciones de cromatina independientes y se realizó un análisis de PCR cuantitativo en tiempo real utilizando un detector de secuencias Applied Biosystems 7700. La eficiencia de inmunoprecipitación se calculó por triplicado normalizando la cantidad de producto de PCR en la muestra inmunoprecipitada por la de TEL control de secuencia. Los datos de unión se presentan como una inducción de veces con respecto a la condición no tratada.

En vivo ensayo de coprecipitación

Ste12-Myc- and/or Kar4-HA-tagged cells in mid-log phase (50 ml) were treated with 1 μM α-factor for 30 min or left untreated and then collected by brief centrifugation at 4°C. Pellets were harvested with glass beads in the FastPrep-24 (Qbiogene, 60s at speed 5) in lysis buffer A (50 mM Tris–HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 15 mM EDTA, 15 mM EGTA, 2 mM DTT, 0.1% Triton X-100, 1 mM PMSF, 1 mM benzamidine, 2 μg/ml leupeptin, 2 μg/ml pepstatin, 25 mM β-glycerophosphate, 1 mM sodium pyrophosphate, 10 mM sodium fluoride, 100 μM sodium orthovanadate), and lysates were clarified by centrifugation and quantified by the Bradford assay (Bio-Rad Laboratories). 1.5 mg of cleared supernatant was subjected to immunoprecipitation with rabbit polyclonal HA tag antibody (Abcam, ab9110) overnight at 4°C. Immunocomplexes were recovered with Dynabeads™ protein A (Invitrogen, 10002D) and washed with lysis buffer. Finally, they were resolved by SDS–PAGE and blotted with mouse monoclonal anti-HA 12CA5 or anti-Myc 9E10 antibodies. As a control, 50 μg of whole-cell extract was also blotted to check the expression levels of the tagged proteins (total).

Northern blot analysis

Yeast strains were grown to mid-log phase in rich medium and then treated with 1 μM α-factor for the length of time indicated. Total RNA and expression of specific genes were probed using radiolabeled PCR fragments containing a fragment of AGA1 ORF (+145/+936 bp), FIG1 ORF (+106/+948 bp), and ENO1 ORF (+1/+1,310 bp). Signals were acquired with a Fujifilm BAS-5000 PhosphorImager and ImageQuantTL software.

MNase nucleosome mapping

Yeast spheroplast preparation and micrococcal nuclease digestions were performed as described previously with modifications (Nadal-Ribelles et al, 2014 , 2015 ). Ste12-Myc and Kar4-HA double-tagged strain was grown to early log phase (A660 0.4–0.6), and samples of 500 ml of culture were exposed to 1 μM α-factor for the indicated length of time. The cells were cross-linked with 1% formaldehyde for 15 min at 30°C, and the reaction was stopped with 125 mM glycine for min. Cells were washed and resupended in 1 M sorbitol TE buffer before cell wall digestion with 100 T zymoliase (USB). Cells were then lysed and immediately digested with 60–240 mU/μl of micrococcal nuclease (Worthington Biochemical Corporation, Lakewood NJ, USA). DNA was subjected to electrophoresis in a 1.5% (w/v) agarose gel, and the band corresponding to the mononucleosome was cut and purified using a QIAquick gel extraction kit (Qiagen). DNA was used in a real-time PCR with specific tiled oligonucleotides covering AGA1 promoter and partial coding sequence (−928/+470) or FIG1 promoter and partial coding sequence (−933/+463) included in Appendix Table S4. PCR quantification was referred to an internal loading control (telomeric region in chromosome 6), and nucleosome occupancy was normalized to 1 at the (−1) nucleosome region of the untreated condition.

Mating experiments

Mating experiments were performed in agar pads loaded into 96-well plates to monitor multiple strains in parallel. Agarose 2% in synthetic medium was heated 5 min at 95°C. Approximately 150 μl of this solution was placed in a small aluminum frame to form a square pad of the proper dimension to fit in a well. After cooling at 4°C for 5 min, the pad was removed from the frame. In parallel, 500 μl of cells at OD600 0.1 were centrifuged. MATa cells were resuspended in 10 μl of synthetic media, and this cell suspension was used to resuspend the MATα cells. 1 μl of this mixture was deposited on the agar pad and placed upside down in a well. Imaging was started roughly 30 min later, after selecting appropriate fields of view. CFP (50 ms), RFP (100 ms), YFP (100 ms), tdiRFP (100 ms), and two bright-field (30 ms) images were recorded every 5 min for 2–3 h. Cells were segmented based on the CFP and bright-field images. After quality control, cells tracked for at least 10 frames were taken into consideration for analysis. Fusion events were defined by a sudden increase of more than 50 in the average nuclear fluorescence in the tdiRFP channel. Cells were considered as non-fusing if their average nuclear fluorescence in the tdiRFP channel did not increase by more than 10 throughout the track.

Disponibilidad de datos

The raw images of the time-lapse movies from the following datasets are available on the IDR repository: main figures experiments, the dose response experiments (Appendix Fig S9), and gene deletion experiments (Fig EV3, Appendix Figs S13 and S14). The DOI is 10.17867/10000114.


Material y métodos

Anti-Alexa Fluor mAb generation

The anti-Alexa Fluor mAbs were derived by immunizing mice (129S6/SvEvTac and SJL/J) with keyhole limpet hemocyanin protein (KLH) conjugated to A488 or A594 using a 13-day rapid immunization multiple sites protocol [14]. The mouse studies described herein were approved by Igenica Biotherapeutics’ Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC Protocol IGA.001 issued to Jan-Willem Theunissen). Mice were euthanized in a carbon dioxide chamber. Target-specific hybridomas were established by electrofusion of lymphocytes isolated from peripheral lymph nodes with the myeloma cell line Sp2/mIL-6 (ATCC, Manassas, VA). The non-quenching chimeric IgG1 isotype control was derived from C1.18.4 (ATCC), a myeloma line that expresses a mouse IgG2a of unknown specificity, by sequencing the rearranged variable regions (S1 Table). The germline identity and the complementarity determining regions (CDRs) of the sequenced variable regions of the quenching mAbs were identified with IMGT (the international ImMunoGeneTics information system http://www.imgt.org) and Kabat’s definition, respectively. To produce the quenching mAbs, the chimeric IgG1 isotype control and the anti-EphA2 mAb 1C1 [15], the sequenced VH regions (including the signal sequences) were cloned in frame with the constant region of the human IgG1 heavy chain (pFUSE-CHIg-hG1, Invivogen, San Diego, CA) using the restriction enzymes EcoRI and NheI. The sequenced VK regions (including the signal sequences) were cloned in frame with the human kappa light chain (pFUSE-CLIg-hK, Invivogen) using the restriction enzymes AgeI and BsiWI. The mAbs were expressed at a 1:2 ratio of heavy to light chain plasmid in the Expi293 Expression System (Life Technologies, Carlsbad, CA), and purified with a standard MabSelect SuRe purification protocol (GE Healthcare, Piscataway, NJ).

Antibody reagents and cell lines

Cell lines (PC-3, HEC-1-A) were obtained from ATCC and cultured as suggested. Antibodies were obtained from the following sources: mouse anti-human EphA2 clone 371805 (MAB3035 [abbreviated as 3035], R&D Biosystems, Minneapolis, MN) Alexa Fluor 488 goat anti-mouse or anti-human IgG antibody and Alexa Fluor 546 goat anti-mouse or anti-rabbit IgG antibody (Life Technologies) anti-LAMP1 clone D2D11, (Cell Signaling, Danvers, MA). Alexa Fluor 647–Phalloidin (cat. no. 8940, Cell Signaling) was used to stain the actin cytoskeleton. Alexa Fluor antibody conjugates were generated using Alexa Fluor 488 and Alexa Fluor 594 5-sulfodichlorophenol esters (Life Technologies). Excess Alexa Fluor dye was removed from the antibody dye conjugate preparation by gel filtration (Thermo Pierce, Rockland, IL). The degree of Alexa Fluor labeling was determined by conducting SDS-PAGE on 1.5 microgram of each dye-conjugated antibody, and scanning unstained or Coomassie-stained gels on a Typhoon (GE Healthcare) or a conventional scanner, respectively. We used a blue laser (488 nm) with a 526 SP emission filter for detection of A488 and a green laser (532 nm) with a 610 BP emission filter for detection of A594. The relative quantities of Alexa Fluor dye on the heavy and light chains were established using ImageQuantTL (GE Healthcare), while the relative quantities of naked antibody were measured using ImageJ [16].

Antibody binding studies

Kinetic measurements for the anti-EphA2 mAbs were established with an Octet QK384 (ForteBio, Menlo Park, CA) using anti-human IgG Fc biosensors (ForteBio, Part No. 18–5064) for 1C1 and anti-mouse IgG Fc biosensors (ForteBio, Part No. 18–5090) for 3035. Anti-EphA2 mAbs were immobilized onto the biosensor surface for 2.5 min and a baseline step was recorded by moving the sensors into 1X Kinetics Buffer (ForteBio, Part No. 18–5032) for 2 min. Association of an eight-point two-fold titration of the recombinant extracellular domain of EphA2 (R&D Systems, Cat. No. 3035-A2-100) starting at 300 nM for 1C1 mAbs and at 200 nM for 3035 mAbs was measured for 5 min and dissociation was recorded by moving the biosensors to 1X Kinetics Buffer for 20 min. Reference biosensors were dipped in 1X Kinetics Buffer during the association step. The sample plate was agitated at 1000 rpm throughout the entire experiment. Data was aligned to the baseline step, reference biosensor subtracted, inter-step corrected by alignment to the dissociation step, and filtered using the Savitzky-Golay equation in Octet Data Analysis 7.0 software. Kinetic data was analyzed and fitted globally using a 1:1 Langmuir binding model. The KD was calculated by dividing the kdis by the ksobre.

Cell-based antibody binding studies were conducted as described [17]. 1x10 5 cells were collected with Cellstripper (Mediatech, Manassas, VA), then incubated with an eleven-point 1:2 dilution series of anti-human EphA2 antibody dye conjugate starting at 200 nM for 3 hr at 4°C. After a wash step and addition of the viability dye 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), 10,000 events were collected on a MACS-Quant flow cytometer (Miltenyi, Auburn, CA). The median fluorescence intensities (MFIs) at each dilution were plotted and an apparent Kd was derived by using the one-site specific binding with Hill slope equation (Prism, GraphPad Software Inc, La Jolla, CA). The Kd values and their associated 95% confidence intervals are reported in S1 Fig.

Quenching activity of anti-Alexa Fluor antibodies

PC-3 cells or anti-human IgG microbeads (Miltenyi) were labeled on ice with 100 nM of anti-human EphA2 antibody, a concentration at which staining is saturated (S1 Fig). After a wash step, the cells or beads were incubated for 30 min with buffer or a 6-point 1:4 dilution series of anti-Alexa Fluor mAb starting at 50 microgram/ml. At 10 microgram/ml of anti-Alexa Fluor mAb or a higher concentration, quenching is saturated for 1C1 conjugates (Fig 1) and 3035 conjugates. After another wash step and addition of DAPI, 20,000 live cells or beads were acquired on a MACS-Quant VYB. The median fluorescence intensity (MFI) at each anti-Alexa Fluor mAb concentration was normalized against the buffer control to obtain a normalized MFI percentage. Half maximal inhibitory concentration (IC50) values were derived by using the log(inhibitor) versus response equation in Prism. The IC50 values and their 95% confidence intervals are reported in Fig 1.

(A) Fluorescence of Alexa Fluor 488 (A488) on microbeads coated with 1C1-A488 or PC-3 cells stained with 1C1-A488 was quenched with a titration of the benchmark, a rabbit anti-A488 polyclonal, or 1 of 3 anti-A488 mAbs. One representative experiment of multiple is shown. (B) Fluorescence of Alexa Fluor 594 (A594) on microbeads coated with 1C1-A594 or PC-3 cells stained with 1C1-A594 was quenched with a titration of 1 of 3 anti-A594 mAbs. One representative experiment of multiple is shown. (A, B) Median fluorescence intensities (MFIs) at each anti-A488 or anti-A594 mAb concentration were normalized against a buffer control. The chimeric IgG1 isotype control was used as a non-quenching mAb control. The IC50 values (microgram/ml) of quenching and the corresponding 95% confidence intervals (95% CI) are listed for both the microbead- and cell-based titrations.

Flow cytometry–based internalization assay using cell surface fluorescence quenching

Cell surface quenching experiments were conducted as described [7]. PC-3 cells were collected with Cellstripper, pre-incubated for 30 min on ice with 15 microgram/ml antibody conjugate in PC-3 culture medium, washed three times with PC-3 culture medium, and incubated at 37°C for the indicated time intervals. Cells were rapidly chilled and incubated for 30 min with (quenched samples) or without (unquenched samples) 50 microgram/ml of anti-A488 or anti-A594 antibody in PBS/0.1%BSA. In unquenched samples 50 microgram/ml of the chimeric IgG1 isotype control antibody was added. 1.5x10 4 live events were acquired on a MACS-Quant VYB after staining the cells with DAPI. On the MACS-Quant VYB the violet laser was used for the excitation of DAPI, the blue laser for the excitation of A488, and the yellow laser for the excitation of A594. The median A488 or A594 fluorescence intensity for viable cells was established using FlowJo software (Tree Star, Ashland, OR). Internalized fluorescence was calculated from quenched and non-quenched sample data by correcting for incomplete surface quenching:

1 –(N1—Q1)/(N1 –(N1Q0/N0)) with N1 = Unquenched MFI at each time point (t1) Q1 = Quenched MFI at t1 Q0 = Quenched MFI for the sample kept on ice (t0) N0 = Unquenched MFI at t0. When cells were incubated with two Alexa Fluor antibody conjugates, each anti-Alexa Fluor antibody was added at 50 microgram/ml during the quenching step.

Internalized fluorescence was plotted and a curve fit was obtained in Prism by nonlinear regression with the one-phase association equation: Y = Y0 + (Plateau—Y0) * (1—exp(-K*x)) with Y0 = 0 when X (time) is zero and Plateau = 100. The summary statistic half-time is the time at which internalized fluorescence is equal to fifty percent and enabled comparison of internalization for the different dye-conjugated anti-EphA2 mAbs. Half-time is in the time units on the X-axis and is computed as the reciprocal of ln(2)/K. For each curve fit the 95% confidence interval for half-time is reported.

Indirect immunofluorescence

PC-3 cells were seeded into six-well plates at

30% confluence and were stained with 5 microgram/ml of EphA2 antibody (1C1 or 3035) for 30 min at 4°C. After 3 washes the cells were incubated at 37°C for the indicated intervals in growth medium. Cells were fixed in 3% paraformaldehyde (PFA) in phosphate buffered saline (PBS). After quenching the PFA with 0.1 M glycine in PBS, cells were permeabilized with a staining buffer (0.4% saponin, 1% BSA, 2% normal goat serum in PBS). The LAMP1 marker antibody incubation, the fluorophore-conjugated secondary antibody incubation, and wash steps were performed in the staining buffer. Cells were imaged at The Gladstone Histology and Light Microscopy Core with a Zeiss LSM510 confocal microscope (Zeiss, Oberkochen, Germany) equipped with a C-Apochromat 63X/1.2W CORR objective lens. The settings for the three different channels were as follows: Cy5 14% of 633 nm laser, 132 micron pinhole, BP650-710 IR filter TRITC 100% of 543 nm laser, 126 micron pinhole, BP565-615 IR filter GFP 17% of 488 nm laser, 128 micron pinhole, BP500-530 IR filter. A control in which 1C1 or 3035 were each detected in two different channels showed colocalization of the secondary antibody reagents (S2 Fig), suggesting that these settings were appropriate for assessment of colocalization.


Materiales y métodos

Yeast strains and media

Strains used are listed in Supplemental Material, Table S1. Strains generated using standard gene replacement protocols. Unless otherwise indicated, yeast cells were grown in YPD medium (2% Bacto Peptone, 1% yeast extract, 2% glucose). All strains are congenic to MATa W303-1a. With the exception of the rDNA copy number mutants used in the copy number change experiments, all strains used have nearly identical rDNA copy number of ∼150 rDNA repeats (Figure S3).

Chromatin immunoprecipitation and micrococcal nuclease digestion followed by deep sequencing

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) and micrococcal nuclease (MNase) digestion were performed as described previously (Rodriguez et al. 2014). For H3-ChIP experiments, anti-H3 C-term antibody (catalog # ab1791 Abcam) was used for all other ChIPs, the targeted protein was epitope-tagged with FLAG and immuno-precipitated using an anti-FLAG monoclonal antibody (catalog # F3165 Sigma). All Isw2 ChIP-seq was performed on a FLAG-tagged, catalytically inactive allele of ISW2 as previously described (Gelbart et al. 2005). All libraries were constructed using the Nugen Ovation Ultralow System V2 (catalog # 0344-32) and then single-end (ChIP-seq) or paired-end (MNase-seq) sequenced, with 50 bp read length, on Illumina Hi-Seq 2500. Ribbon plots, bar graphs, and line graphs were generated with the ggplot2 R package (http://ggplot2.org/). For MACS2 peaks-calling, the following parameters were used: macs2 callpeak -t <filename>.bam -c <filename_sorted>.bam -f BAM -g 1.21e7 -B–nomodel–extsize 147.

For all depictions of deep-sequencing data at the rDNA, a single copy of the rDNA locus is shown. Our reference genome contains two copies of the rDNA, and any read mapping to the rDNA is randomly assigned to one of these two copies. Thus, sequencing data reflects the average signal across all rDNA repeats in all cells sampled. For ChIP-seq analyses, IP and input DNA from the same chromatin prep were both sequenced. Normalization of IP to input was done using these matched samples, thus controlling for any minor variation in rDNA copy number that might otherwise affect direct comparison between different samples.

Reverse transcription- and ChIP-quantitative PCR

RNA was isolated using hot acid phenol, then cleaned up with the Qiagen RNeasy Cleanup Kit (catalog # 74204) plus on-column treatment with DNase I (catalog # 79254 Qiagen). cDNA was generated from the RNA using Superscript III Reverse Transcriptase (catalog # 18080093 ThermoFisher). Quantitative PCR was performed on both cDNA and ChIP DNA using 2× Power SYBR Master Mix (catalog # 4367659 Fisher Scientific) run on the ABI QuantStudio5 Real Time PCR System machine.

Psoralen crosslinking

The psoralen crosslinking assay was performed as previously described (Dammann et al. 1993 Smith and Boeke 1997 Sandmeier et al. 2002). Cells were grown to midlog phase (OD660 = 0.5–0.7), ∼3 × 10 8 cells were collected, washed twice with ice-cold water, and then resuspended in 1.4 ml cold TE buffer. Cells were transferred to six-well plates, and 70 μl of psoralen (200 μg/ml in 100% ethanol) was added to the cells. On ice, the plates were irradiated with 365 nm UV for 5 min. Psoralen addition followed by UV irradiation was repeated four additional times, for a total of five rounds. Cells were collected, washed in water, spheroplasted with zymoylase 100T, and washed in spheroplast buffer. The pellet was lysed by resuspension in TE buffer with 0.5% SDS, and then treated with Proteinase K overnight at 50°. DNA was extracted with phenol:chloroform:IAA, ethanol precipitated, and then digested for 3 hr with EcoRI-HF. Samples were treated with RNase A at 37° for 30 min, ethanol precipitated, quantified, and then run in 1.3% LE agarose gels in 0.5× TBE for 24 hr at 60 V. Gels were irradiated for 2 min per side with 254 nm UV, transferred to a GeneScreen Plus membrane in 10× SSC, and then hybridized with a probe contained within a EcoRI restriction fragment in the rDNA ETS1. Membranes were visualized using a Typhoon Phosphor Imager, and images were visualized using ImageJ software.

Two-dimensional gel electrophoresis

DNA sample preparation based on the Brewer/Raghuraman laboratory protocol (http://fangman-brewer.genetics.washington.edu/plug.html). Cells were grown to midlog phase (OD660 = 0.5–0.7), sodium azide added to 0.1% final concentration, and then cultures were washed in water. Cell pellets were resuspended in 50 mM EDTA, mixed with an equal volume of 1.0% Low-Melt Agarose (catalog # 161−3111 Bio-Rad), and pipetted into plug molds. Cells in plugs were spheroplasted with 0.5 mg/ml Zymolyase 20-T, thoroughly washed, and stored in TE at 4°. Plugs were digested with NheI for 5 hr at 37°, then run in 0.4% agarose gels in TBE at 1 V/cm for 22 hr at room temperature. Gels were stained with ethidium bromide (EtBr), visualized with UV, and the desired size range for each sample was identified in the gel and physically cut out. This piece of gel was then rotated 90° and placed in a new gel tray, and warm 1.1% agarose in TBE was poured around it. This gel was then run at 5 V/cm for 6 hr at 4°. After running, the gel was visualized, transferred onto a GeneScreen Plus membrane (catalog # NEF986001PK Perkin Elmer), and hybridized with a probe encompassing the RFB.

RDNA copy number change assay

Strains were made from YSI102 (Ide et al. 2010), in which the endogenous FOB1 gene had been deleted, and the number of rDNA repeats reduced to 20 copies. From the 20-rDNA-copy fob1 parent, isw2∆, nhp10∆, y isw2∆ nhp10∆ strains were generated. Separately, the FOB1 gene was Gibson cloned into the pRS426 plasmid. Either this FOB1-pRS426 plasmid or a pRS426 plasmid with no FOB1 gene was then transformed into each 20-copy strain and plated on yeast complete (Bywater et al.) –URA medium with 2% glucose. Individual transformants were restreaked on selective medium, the presence of the desired plasmid was confirmed by PCR, and then transformants were inoculated into liquid YC –URA + 2% glucose. Cultures were allowed to reach saturation, and then aliquots were collected, washed in cold 50 mM EDTA, and cell pellets frozen in liquid nitrogen and stored at −80°. From the remaining saturated cultures, all strains were diluted by the same factor, then allowed to grow back to saturation, at which point the next time point would be collected, up to ∼200 generations. Generations were calculated from the base 2 log of the dilution factor applied at each passage (for example, a saturated culture diluted by a factor of 1024 into the same volume of medium would require 10 generations to return to saturation).

Clamped homogenous electric field gel electrophoresis and southern blotting

Samples for clamped homogenous electric field (CHEF) gels were prepared in agarose based on a previously described method (Kwan et al. 2016). Frozen cell pellets were thawed, resuspended in 100 mM EDTA, then mixed with 0.8% low-melt agarose and 25 mg/ml zymolyase 20T. This mixture was pipetted into plug molds, allowed to solidify at 4°, then washed with a series of buffers (Solution V: 500 mM EDTA pH 7.5, 10 mM Tris pH 7.5 Solution VI: 5% sarcosyl, 5 mg/ml proteinase K, 500 mM EDTA pH 7.5 Solution VII: 2 mM Tris pH 7.5, 1 mM EDTA, pH 8.0). Before being run, plugs were incubated for ∼30 min in 0.5× TBE running buffer at 4° before being placed on gel comb teeth, positioned in gel mold, and then warm 0.8% 0.5× TBE was poured. The CHEF gel was run on a CHEF-DR II device with a program adapted from Ide et al. 2007: Block 1 = 2.0 V/cm, pulse time of 1200–1400 sec, total run time 72 hr Block 2 = 6.0 V/cm, pulse time of 25–146 sec, total run time 7.5 hr. After electrophoresis, gels were incubated with 0.5 μg/ml EtBr in running buffer for 30–45 min, UV-irradiated with a Stratagene Stratalinker to nick DNA, transferred onto HyBond N+ positively charged membrane (catalog # RPN303B GE), and hybridized with a probe targeting the RFB.

URA3 recombination assay

Strains were generated by integration of linearized plasmid pRS406 containing the URA3 gene. Cells were streaked onto YC-URA plates, single colonies were inoculated into liquid YC-URA medium, and cultures were grown to saturation. Culture concentrations were measured, and a known number of cells were inoculated into YPD. Cultures were grown for 24 hr, and the concentration was measured and used to calculate the number of generations elapsed without selection. Cells were diluted to yield a countable number of colonies, and then plated on both YPD and 5-fluoroorotic acid (5-FOA) plates. 5-FOA-resistant colonies were interpreted as the product of recombination events that led to the loss of URA3, and the number of recombination events per cell per generation was calculated.

Disponibilidad de datos

All strains (Table S1) and plasmids (Table S3) used in this study are available upon request, and oligonucleotide sequences are included in Table S2. All genomics data are available at GEO under the accession number GSE112465. The authors affirm that all data necessary for confirming the conclusions of the article are present within the article, figures, supplemental material, and genomics data. Supplemental material available at Figshare: https://doi.org/10.25386/genetics.7243292.


FOOTNOTES

This article was published online ahead of print in MBC in Press ( http://www.molbiolcell.org/cgi/doi/10.1091/mbc.E05-07-0685) on October 12, 2005.

Abbreviations used: DTT, dithiothreitol eIF2, eukaryotic initiation factor 2 ER, endoplasmic reticulum PERK, RNA-activated protein kinase-like endoplasmic reticulum kinase poly(A), polyadenylic acid poly(I), polyinosinic acid poly(U), polyuridylic acid RNP, ribonuclear particle SRP, signal recognition particle.