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¿El promotor de CMV es activo en la levadura?

¿El promotor de CMV es activo en la levadura?


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Deseo transfectar levadura y quiero controlar mi eficiencia. Entonces pensé en usar pEGFP-N1 como control. El EGFP es impulsado por un promotor de CMV. ¿Puede la levadura leer los promotores de CMV? Gracias Hermann


Si (referencia)

Si bien encontré su pregunta interesante, este fue prácticamente el primer resultado cuando escribí "levadura CMV" en Google Scholar. ¡Realmente deberías mirar allí primero antes de preguntar!


El potenciador temprano de CMV / promotor de β actina de pollo (CAG) se puede utilizar para impulsar la expresión del transgén durante la diferenciación de células madre embrionarias murinas en progenitores vasculares.

Cultivo de células madre embrionarias de ratón in vitro tienen la capacidad de diferenciarse en células de las tres capas germinales, así como en células germinales. La diferenciación imita los eventos del desarrollo temprano, incluida la vasculogénesis y la angiogénesis temprana, y se están utilizando varios sistemas de diferenciación para identificar factores que son importantes durante la formación del sistema vascular. Las células madre embrionarias son difíciles de transfectar, mientras que se ha informado de la regulación a la baja de la actividad promotora tras la selección de transfectantes estables, lo que dificulta el estudio de proteínas por sobreexpresión.

Resultados

Las células madre embrionarias de ratón CCE se diferenciaron en colágeno tipo IV durante 4-5 días, las células mesodérmicas Flk1 + se clasificaron y se volvieron a sembrar en colágeno tipo IV en presencia de VEGFA para dar lugar a células endoteliales y células de músculo liso o en colágeno tipo I geles para la formación de tubos vasculares. La actividad de los promotores de CMV y β-actina se reguló negativamente durante la selección de transfectantes estables y durante la diferenciación a la etapa Flk1, mientras que el potenciador inmediato de CMV / promotor de β-actina en el vector pCAGIPuro-GFP condujo a un 100% de transfectados de manera estable indiferenciados y células diferenciadas que expresan GFP. Para probar más este sistema, expresamos sindecan-2 y -4 en estas células y demostramos altos niveles de expresión transgénica tanto en células indiferenciadas como en células diferenciadas a la etapa Flk1.

Conclusión

Los vectores que contienen el promotor CAG ofrecen una herramienta valiosa para la expresión a largo plazo de transgenes durante la diferenciación de células madre hacia el mesodermo, mientras que los promotores de CMV y β-actina conducen a una expresión transgénica muy pobre durante este proceso.


Fondo

Una de las características de la biología sintética es el diseño de novo y la síntesis de componentes y dispositivos biológicos funcionales. Los promotores son especialmente importantes para controlar los modos de regulación y la fuerza de la expresión génica, generando cantidades adecuadas de enzimas para optimizar el metabolismo celular. La levadura es uno de los chasis más utilizados en la investigación de la biología sintética, presentando un excelente rendimiento como fábricas de células para producir una variedad de bioquímicos valiosos [1, 2, 3]. Las fortalezas apropiadas de los promotores afectaron drásticamente la eficiencia de las rutas sintéticas heterólogas en la levadura y las consiguientes composiciones del producto [4, 5, 6, 7]. Trabajos recientes han establecido la arquitectura modular de los promotores de levadura, como en la levadura de panadería. Saccharomyces cerevisiae, metilotrófico Pichia pastoris y oleaginoso Yarrowia lipolytica [8,9,10,11,12,13]. El trabajo de Redden y Alper es especialmente sobresaliente, ya que definieron y demostraron un modo de diseño de promotor de levadura mínimo que conservaba altos niveles de expresión con una reducción de tamaño de casi el 80% [8]. El promotor de levadura modular mínimo consta de varias partes básicas en orden, a saber, secuencia de activación híbrida aguas arriba (UAS), espaciador neutro rico en AT, caja TATA, N30 promotor central y sitio de inicio transcripcional (TSS). Este trabajo ofrece una gran oportunidad para diseñar promotores artificiales con secuencias más generalizadas.

Entre estas partes modulares, UAS, espaciador rico en AT, TATA-box y TSS tienen características conservadoras distintivas, ya que solo un número limitado de secuencias naturales o artificiales preservarían o mejorarían la fuerza del promotor, pero la mayoría de las secuencias diseñadas disminuyen drásticamente la fuerza del promotor [6, 8,9 , 10,11,12,13,14,15,16]. Por el contrario, la secuencia del promotor central aguas abajo de la caja TATA influyó en la velocidad de deslizamiento de la ARN polimerasa II antes de que se generara el ARNm, lo que también determina la actividad máxima del promotor. Esta región permite más espacio de diseño artificial, pero también tiene su propia limitación, ya que las secuencias completamente aleatorias abrumarán a las secuencias efectivas que mejoran la fuerza del promotor. El trabajo reciente de Portela y sus colegas ofreció una oportunidad notable para diseñar un modo universal de promotor central que podría usarse en diferentes especies de levadura [17]. Todavía queda la duda de si esta región puede ser reemplazada por una secuencia artificial diseñada de novo.

Desde otro ángulo, necesitamos este tipo de promotores artificiales diseñados de novo como códigos de barras para marcar la expresión génica a nivel del genoma para investigar el reordenamiento del genoma [18, 19]. Los códigos de barras artificiales de los promotores ayudarán aún más al análisis de la evolución genómica sintética. Teniendo en cuenta este punto, planeamos construir una serie de secuencias promotoras centrales artificiales y caracterizar sus actuaciones para obtener algún tipo de regla. En el presente estudio, construimos promotores centrales artificiales en Y. lipolytica, que fue diseñado para producir sustancias químicas valiosas como derivados de ácidos grasos, ácidos orgánicos, terpenoides y esteroles [20, 21, 22]. Elegimos un objeto existente de que los promotores artificiales podrían mejorar los niveles de expresión de la enzima CrtY para obtener una mayor producción de betacaroteno del sustrato licopeno (Fig. 1). Pudimos seleccionar rápidamente los promotores deseables contenidos en las colonias de levadura con diferentes colores de rojo-naranja-amarillo que presentaban diferentes composiciones de licopeno-caroteno (Fig. 1). Las colonias con una producción de licopeno de 1,2 mg / g de DCW y mucho más de 25 mg / g presentarían un espectro de color muy diferenciado. Diseñamos dos series de N30 promotores centrales. Las primeras series se ubicaron aguas abajo de un promotor natural PEXP1 y reemplazó las 55 bases originales entre TATA-box y TSS en PEXP1. La segunda serie reemplazó la región original de 61 bases entre TATA-box y el TSS en otro promotor natural PGPD. Ambos promotores se usaban comúnmente y obviamente poseían fortalezas más fuertes que otros promotores. Dado que N30 era una biblioteca grande, aquí nos enfocamos en probar las influencias de los módulos ricos en T y los módulos ricos en G / C en la fortaleza del promotor principal.

Concepto de cribado de promotores de núcleos artificiales asistidos por espectro de color de colonias de levadura. Los promotores artificiales diseñados cambiaron el nivel de expresión de la enzima CrtY y ajustaron la composición de licopeno-caroteno, lo que condujo a una distribución variable del color de las colonias de levadura. En la cepa con baja producción de licopeno, observamos dos colores como el rojo claro original y el amarillo claro nuevo. En la cepa de mayor producción de licopeno, observamos tres colores como el rojo original y el nuevo naranja y amarillo.


Resultados

Un sistema retroviral modificado capaz de eliminar y expresar genes

Los macrófagos primarios de ratón son difíciles de transfectar o nucleofectar. Sin embargo, pueden infectarse con retrovirus. Comparamos varios vectores retrovirales comercializados y encontramos que pSuper-Retro-puro de Oligoengine funcionó mejor para la producción de virus. Tiene al menos dos características confirmadas, una es la expresión de ARNhc impulsada por el promotor H1, la otra es la expresión del marcador de resistencia a fármacos de puromicina impulsada por el promotor PKG. Sin embargo, el promotor H1 puede no funcionar con la misma fuerza que un promotor U6 para la expresión de shRNA (16), y este vector carece de los sitios de clonación para la expresión génica exógena. Por lo tanto, modificamos este vector en un nuevo vector retroviral, capaz de eliminar y expresar genes mientras se reserva la función de expresión de resistencia a puromicina. Como se ilustra en la Figura 1A, eliminamos el promotor H1 en pSuperRetro-puro y reservamos los sitios de clonación múltiples (MCS1) para la clonación del promotor U6 que impulsa la expresión del ARNhc. Se ha demostrado que el promotor UbiC humano es constitutivamente activo en una variedad de células y tejidos (27), y se seleccionó para impulsar la expresión de un gen exógeno y un gen de resistencia a puromicina separados por el promotor SV40. MCS2 entre UbiC y SV40 permite la clonación de genes exógenos. Derivamos vectores con Flag-His6 (FH) C-terminal para permitir la inmunotransferencia o inmunoprecipitación de la proteína expresada, y nombramos este nuevo vector como pFRRu. El otro vector pFRRg tiene la misma estrategia de diseño, pero el promotor UbiC se reemplazó con el promotor PKG (Figura 1B). Con estos nuevos vectores retrovirales hemos transducido una variedad de tipos de células de ratón (p.ej., células epiteliales, queratinocitos, fibroblastos y células hematopoyéticas) así como células primarias [p.ej., fibroblastos embrionarios de ratón y macrófagos derivados de la médula ósea (BMDM)]. La eficacia de la transducción varía según el tipo de célula y el título de virus aplicado. Sin embargo, después de la selección con puromicina, todas las células residuales se transdujeron viralmente. En este estudio, el título viral que aplicamos condujo a una eficiencia de transducción del 30% al 60% para los macrófagos, evitando múltiples entradas de transcripciones virales en una célula.

Un sistema retroviral modificado con funciones de eliminación de genes y expresión de genes exógenos. A. Mapa del vector retroviral modificado con el promotor UbiC. El pFRRu se generó como se describe en Materiales y métodos. Hay dos sitios de clonación múltiples: el extremo 5 & # x02032 de UbiC tiene los sitios de clonación múltiples para el casete de expresión de shRNA (MCS1), y el extremo 3 & # x02032 de UbiC tiene los sitios de clonación múltiples para la expresión de genes exógenos (MCS2) que contienen un -Etiqueta Flag-His6 (FH) de marco. La expresión de resistencia a puromicina (puro) se reservó con el promotor SV40. B. El vector retroviral modificado con el promotor PKG. El promotor UbiC como se describió anteriormente se reemplazó con el promotor PKG.

Inhibición de la actividad del promotor de U6 mediante la disposición divergente del promotor de U6 y UbiC

Por lo general, tres arreglos de promotores pueden conducir a TI, a saber, promotores convergentes, promotores en tándem y promotores superpuestos (divergentes) (26). Dado que la disposición del promotor convergente para U6 y otros promotores es poco común en los vectores virales, nos centramos en las disposiciones de promotores divergentes y en tándem para explorar qué disposiciones condujeron a un deterioro significativo de la actividad del promotor U6. Construimos el promotor U6 que conduce el casete de expresión del ARNhm de mCIN85 e insertamos este casete de expresión en MCS1 de pFRRu en diferentes orientaciones. Una era la disposición divergente del promotor en la que U6 y UbiC estaban en dirección opuesta (pU6sh-pUbiC divergente), y la otra era en tándem en la misma dirección que UbiC (pU6sh-pUbiC-tándem). También generamos un vector de expresión de shRNA de luciferasa como control de shRNA no específico y un shRNA de pFRRrfp-U6-mCIN85 como control para minimizar la interacción del promotor reemplazando el promotor UbiC con un fragmento de ADN no promotor (Figura 2A). Estos vectores se introdujeron en células Plat E para producir virus. Las BMDM se transdujeron con los respectivos virus y posteriormente se seleccionaron con puromicina para eliminar las células no transducidas. Después de cuatro días de selección, las células restantes se lisaron para la extracción de proteínas. Se llevaron a cabo transferencias de Western usando anticuerpo anti-CIN85 de conejo (Figura 2B). La actividad promotora relativa de U6 se determinó usando el nivel de proteína mCIN85 endógena normalizado frente al nivel de & # x003b1-tubulina como control de carga. Como se muestra en la Figura 2C, la disposición del promotor U6 en relación con el promotor UbiC en el vector tuvo un impacto significativo en la actividad del promotor U6. La disposición en tándem mantuvo una actividad promotora de U6 mucho mayor que la disposición divergente. Esto sugirió que la actividad del promotor de U6 puede ser regulada por TI de una manera dependiente de la disposición del promotor.

La disposición divergente del promotor de U6 y UbiC inhibe la actividad del promotor U6. A. Diagrama de arreglos de promotores U6 y UbiC. El casete de expresión de ARNhc de mCIN85 se construyó como se describe en Materiales y métodos, y se insertó en pFRRu para formar disposiciones promotoras divergentes y en tándem. El control mínimo de la actividad del promotor U6 interferido se estableció reemplazando el promotor UbiC con un fragmento de ADNc no promotor de RFP. B. Nivel de proteína mCIN85 endógena residual para reflejar la actividad del promotor U6. Se transdujeron BMDM de ratón con retrovirus producidos con diferentes vectores como se indica. Cuatro días después de la transducción viral y la selección del fármaco, se recogieron y lisaron las células residuales. Se realizaron transferencias de Western usando anti-CIN85 de conejo purificado como anticuerpo primario. C. La eficacia de anulación de mCIN85 normalizada refleja la actividad relativa del promotor U6. Las secuencias de muestra son las indicadas en el Panel B. Los valores son estadísticas de tres experimentos independientes.

El potenciador de CMV impacta negativamente en la actividad del promotor U6 en presencia del promotor UbiC

Estudios anteriores han demostrado que el potenciador de CMV tiene un efecto positivo sobre la actividad del promotor U6 (23). Sin embargo, se desconoce el efecto del potenciador de CMV sobre la actividad del promotor U6 en presencia de TI. Para responder a esta pregunta, colocamos un potenciador de CMV entre los promotores U6 y UbiC en ambos arreglos de promotores fusionando el potenciador con el promotor aguas arriba de UbiC o U6 (Figura 3A). Luego probamos la actividad del promotor U6. Para nuestra sorpresa, en lugar de mejorar la actividad del promotor de U6, el potenciador de CMV en las cuatro configuraciones fortaleció significativamente el efecto inhibidor de UbiC sobre la actividad del promotor de U6 en ambas disposiciones del promotor (Figura 3B y C). Sin embargo, el nivel de inhibición varió con las disposiciones del promotor. La fusión del potenciador de CMV corriente arriba de U6 y manteniendo la disposición en tándem de los promotores proporcionó una inhibición relativamente menor, mientras que la configuración divergente proporcionó la inhibición más alta. Este resultado indica que el potenciador de CMV puede potenciar el TI e inhibir significativamente la actividad del promotor U6 en presencia del promotor UbiC en cualquiera de las disposiciones del promotor.

Impacto negativo de UbiC sobre la actividad del promotor U6 mejorado en presencia del potenciador de CMV. Se siguieron las leyendas de la Figura 2, excepto que el potenciador de CMV se colocó entre el promotor U6 y UbiC o se fusionó con la corriente arriba de U6 como se representa. A. Diagrama de las disposiciones del promotor U6, el potenciador de CMV y el promotor de UbiC. El potenciador de CMV se fusionó corriente arriba del promotor U6 o del promotor UbiC formando disposiciones divergentes o en tándem como se indica. B. Western blot de mCIN85 para reflejar el mCIN85 residual que queda en las células. Las muestras se generaron usando diferentes transducción de virus como se indica. C. Actividad promotora relativa de U6 después de la normalización frente a & # x003b1-tubulina. Los valores son estadísticas de tres experimentos independientes.

La regulación de la actividad del promotor U6 por TI es específica del promotor

La TI a menudo se origina a partir de la fuerza asimétrica de dos promotores estrechamente dispuestos, el promotor más fuerte reduce la actividad del más débil (26). El promotor UbiC es ubicuamente activo en una variedad de células y es un promotor relativamente fuerte (27). A continuación, preguntamos si se puede mantener la actividad del promotor U6 si reemplazamos el promotor UbiC con un promotor PKG más débil para equilibrar la fuerza previamente asimétrica. Construimos vectores virales similares en ambas disposiciones del promotor U6 con el promotor PKG como se muestra en la Figura 4A y probamos la actividad del promotor U6 en BMDM transducidas. Como se esperaba, no se observó una inhibición significativa de la actividad del promotor U6 en ninguna de las disposiciones (Figura 4B y C). Este resultado sugiere que la regulación de la actividad del promotor U6 por TI es específica del promotor. Equilibrar la fuerza de los dos promotores adyacentes es la clave. PKG, un promotor más débil, tiene un efecto TI mínimo sobre la actividad del promotor U6.

La respuesta de la actividad del promotor U6 a TI es específica del promotor. Se siguieron las leyendas de la Figura 2 excepto que el promotor UbiC se reemplazó con el promotor PKG. A. Diagrama de arreglos de promotores U6 y PKG. B. Nivel de proteína mCIN85 endógena residual para reflejar la actividad del promotor U6. C. Actividad promotora relativa de U6 después de la normalización frente a & # x003b1-tubulina. Los valores son estadísticas de tres experimentos independientes.


Visualización de la actividad genética en células vivas.

Se cree que la estructura de la cromatina juega un papel fundamental en la expresión génica. Utilizando el laca operador / represor y dos variantes de color de la proteína verde fluorescente (GFP), desarrollamos un sistema para visualizar un gen y su producto proteico directamente en las células vivas, lo que nos permite examinar la organización espacial y el momento de la expresión génica. en vivo. Se observaron cambios morfológicos dinámicos en la estructura de la cromatina, de una estructura condensada a una abierta, tras la activación del gen, y se visualizó directamente en las células vivas la orientación del producto génico, el indicador de la proteína fluorescente cian (CFP) a los peroxisomas. Descubrimos que el locus del gen integrado estaba rodeado por un cuerpo nuclear de leucemia promielocítica (LMP). La asociación era independiente de la transcripción, pero dependía de la en vivo unión de proteínas específicas (EYFP /laca represor, receptor de tetraciclina / transactivador VP16) al locus. La capacidad de visualizar la expresión génica directamente en células vivas proporciona un poderoso sistema con el que estudiar la dinámica de eventos nucleares como la transcripción, el procesamiento del ARN y la reparación del ADN.


DISCUSIÓN

La dirección mitocondrial de las proteínas de la membrana externa ancladas en C aún no se ha investigado a fondo. Como primer paso para aclarar sus mecanismos de focalización, caracterizamos la señal de focalización mitocondrial utilizando las fusiones GFP-Tom5 como modelo. Debido a que las fusiones fluorescentes de GFP expresadas in vivo poseen un "pliegue estrecho" y el péptido Tom5 unido al C-terminal de GFP puede ser tan corto como 50 residuos, el C-terminal de Tom5 siempre debe exponerse a la superficie del activo fluorescente. molécula. Por tanto, la fluorescencia representa proteínas correctamente plegadas y, por tanto, el presente ensayo descarta la asociación inespecífica de las proteínas desplegadas a varios orgánulos. Nuestros resultados demostraron que la TMS con 18-20 residuos hidrófobos y cargas positivas en el siguiente segmento C son determinantes importantes para la orientación mitocondrial. La importancia del segmento C como señal de direccionamiento mitocondrial se mostró más claramente en el experimento de la Figura 2, el segmento C de Tom5 trasplantado al C-terminal del citocromo.B5, dirigida de otro modo la proteína dirigida al ER a las mitocondrias, o viceversa. Al reducir el número de cargas positivas en el segmento C, los mutantes perdieron gradualmente la especificidad de la membrana y se distribuyeron no solo a las mitocondrias sino al RE, lo que indica que se requieren al menos tres aminoácidos básicos en el segmento C para la especificidad focalización de Tom5 en las mitocondrias.

La especificidad de la membrana también se perdió cuando se alargó el TMS, aunque el segmento C permaneció intacto (Figura 4). En vista del informe de que las fuerzas hidrofóbicas impulsan la inserción espontánea de la membrana (Enoch et al., 1979 Rachubinski et al., 1980 Anderson et al., 1983), esperamos que el TMS alargado funcione como una señal de inserción de membrana inespecífica dominante (Blobel, 1980) por su mayor afinidad con la bicapa lipídica, y las proteínas mutadas se distribuyeron por todas las membranas, incluidas las mitocondrias y el RE, aunque si estas las construcciones también localizadas en los otros sistemas de membranas quedan por determinar.

Tomados en conjunto, tres residuos de aminoácidos básicos colocados en el extremo C del TMS con una longitud apropiada funcionaron como la señal de direccionamiento mitocondrial. Esta característica estructural también se conserva en VAMP-1B mitocondrial (Figura 1). Cuando ambos residuos de arginina o los tres residuos se cambiaron a treonina, los mutantes se transportaron a las membranas de los orgánulos secretores a través del RE (Isenmann y Wattenberg, 1998). El presente estudio demostró que la longitud, más que la hidrofobicidad, es el principal determinante de la función de TMS [Figura 4, TM (H)]. En apoyo de esto, VAMP-1B tiene una TMS de 17 residuos con una hidrofobicidad media de 3,20, sin embargo, se localizó en las mitocondrias. Por lo tanto, parece ser la longitud, más que la hidrofobicidad, lo que determina la orientación a la membrana externa mitocondrial, la longitud podría ser necesaria para adaptarse al grosor de la bicapa lipídica de la membrana externa mitocondrial.

La inserción de cinco residuos de serina entre el TMS y el segmento C interfirió gravemente con el direccionamiento mitocondrial de Tom5, mientras que su adición al extremo C-terminal fue ineficaz. Por lo tanto, la distancia entre el TMS hidrófobo y el segmento C básico es un factor crítico para el direccionamiento mitocondrial. Esta observación es consistente con la observación anterior de que la arginina que se localiza justo después de la TMS en OMb es más crítica para el direccionamiento mitocondrial que otra arginina localizada en el lado distal C-terminal (Kuroda e Ito, 1998 Figura 1).

Hubo una diferencia entre la primera y la segunda mitad del TMS en la sensibilidad a la mutación introducida. Una deleción de un solo aminoácido dentro de la segunda mitad del TMS (40 M-45V) interfirió con la función de direccionamiento mitocondrial más fuertemente que una deleción de un solo aminoácido dentro de la mitad anterior del TMS (Figura 6). Estos resultados nuevamente indicaron que el TMS y el segmento C básico deberían estar dentro de una distancia o contexto adecuados. En conjunto, algunos factores del citosol podrían reconocer estas características estructurales y dirigirlas a la membrana externa mitocondrial.

El dominio C-terminal de Tom5, que consiste en el TMS y el segmento C, cuando se trasplanta al N-terminal de GFP, funcionó como una señal de dirección ER, probablemente como el ancla de la señal (Kida et al., 2000). Por lo tanto, estos segmentos deben estar ubicados en el extremo C para ser reconocidos correctamente como la señal de dirección mitocondrial. Los requisitos estructurales de las señales de dirección mitocondrial para proteínas ancladas en N y ancladas en C son claramente distintos. Teniendo en cuenta que la subunidad ribosómica grande alberga el péptido extendido de 39 residuos (Blobel y Sabatini, 1970), la señal de dirección mitocondrial de Tom5 así caracterizada está casi completamente protegida dentro de la subunidad ribosómica grande. Por tanto, la reacción de direccionamiento debe continuar durante el procesamiento postraduccional, que probablemente evade el reconocimiento por SRP, porque el reconocimiento por SRP del péptido señal ocurre en el complejo ribosoma-cadena naciente de forma cotraduccional (Walter y Johnson, 1994).

Las características estructurales de la señal así definida usando levadura Tom5 estaban bien conservadas en proteínas de anclaje de cola C de mamíferos Vamp1B (Isenmann y Wattenberg, 1998 discutidas anteriormente) y OMP25. Las construcciones GFP-Tom5 ancladas a la membrana y GFP-OMP25 estaban presentes en estado disperso en las membranas externas y no integradas en el complejo TOM. Por lo tanto, GFP-Tom5 puede considerarse como el modelo que representa las proteínas de anclaje de la cola C generales que no están restringidas a la maquinaria de importación de TOM, sino que finalmente se dispersan en las bicapas lipídicas. Estas proteínas parecían estar dirigidas a través de una vía idéntica porque se importaron a mitocondrias que habían sido tratadas con tripsina para eliminar los receptores de importación de la membrana externa rTOM70, rTOM20, rTOM22 y OM37 (nuestros datos no publicados), aunque la participación del componente del canal El rTOM40 queda por analizar.

El sistema de ensayo heterólogo con levadura Tom5 nos permitió distinguir entre los pasos de integración de la membrana y la focalización en las mitocondrias de mamíferos. GFP-Tom5 de tipo salvaje expresado en células COS-7 se dirigió correctamente a las mitocondrias como se observó bajo microscopía confocal, pero se integró de manera ineficiente en la membrana mitocondrial, mientras que la misma construcción expresada en células de levadura se integró de manera eficiente en la membrana mitocondrial. Al aumentar la hidrofobicidad del TMS, el constructo de fusión TM (H) ahora estaba firmemente anclado a la membrana mitocondrial. Estos resultados sugieren que las características de la señal de direccionamiento de las proteínas de anclaje de la cola C son distintas entre las levaduras y los mamíferos. De hecho, los residuos de aminoácidos básicos en el segmento C de GFP-Tom5 no fueron necesarios para la correcta orientación e inserción mitocondrial de GFP-Tom5 en levadura (Horie, Sakaguchi y Mihara, datos no publicados). La caracterización de la señal de dirección mitocondrial de las proteínas de anclaje de la cola C en la levadura está en curso.

¿Cómo se reconocen estas características de la señal en el citoplasma durante la orientación postraduccional? El complejo asociado a polipéptidos nacientes (NAC), que se ha caracterizado como la chaperona heterodimérica asociada a ribosomas que previene la interacción promiscua entre SRP y los polipéptidos nacientes destinados a compartimentos celulares distintos de la vía secretora (Wiedmann et al., 1994), participa en el direccionamiento de preproteínas a las mitocondrias en levaduras (George et al., 1998 Fünfschilling y Rospert, 1999). Levadura Δegd2mutantes, que carecen de la función NAC, acumulan GFP-Tom22 y GFP-Bcl2 en el citosol (Egan et al., 1999). El NAC parece funcionar como un acompañante general para mantener in vivo la competencia del precursor para dirigirse a los orgánulos. Los presentes hallazgos de que la TMS y el segmento C básico deben estar dentro de un contexto o distancia apropiados para la función de dirección mitocondrial sugieren que algunos factores, además de la NAC, que reconocen específicamente estas características y estabilizan la proteína naciente hidrófoba en el citosol, participan en la focalización.


Contenido

Dentro de Herpesviridae, CMV pertenece a la Betaherpesvirinae subfamilia, que también incluye los géneros Muromegalovirus y Roseolovirus (virus del herpes humano 6 y betaherpesvirus humano 7). [7] También está relacionado con otros virus del herpes dentro del Alphaherpesvirinae subfamilia, que incluye los virus del herpes simple 1 y 2 y el virus de la varicela-zoster, y el Gammaherpesvirinae subfamilia, que incluye el virus de Epstein-Barr y el virus del herpes asociado al sarcoma de Kaposi. [6]

Varias especies de Citomegalovirus han sido identificados y clasificados para diferentes mamíferos. [7] El más estudiado es citomegalovirus humano (HCMV), que también se conoce como betaherpesvirus humano 5 (HHV-5). Otras especies de CMV de primates incluyen citomegalovirus de chimpancé (CCMV) que infecta a chimpancés y orangutanes, y citomegalovirus de simio (SCCMV) y Citomegalovirus Rhesus (RhCMV) que infectan a los macacos CCMV se conoce como ambos panine beta herpesvirus 2 (PaHV-2) y pongine betaherpesvirus 4 (PoHV-4). [8] SCCMV se llama Cercopithecina betaherpesvirus 5 (CeHV-5) [9] y RhCMV, Cercopithecina betaherpesvirus 8 (CeHV-8). [10] Otros dos virus encontrados en el mono nocturno se ubican provisionalmente en el género Citomegalovirus, y se llaman herpesvirus aotus 1 y herpesvirus aotus 3. Los roedores también tienen virus anteriormente llamados citomegalovirus que ahora se reclasifican bajo el género Muromegalovirus este género contiene citomegalovirus de ratón (MCMV) también se conoce como betaherpesvirus murido 1 (MuHV-1) y los estrechamente relacionados Betaherpesvirus múrido 2 (MuHV-2) que se encuentra en ratas. [11]

Especies Editar

El género consta de estas 11 especies: [5]

  • Aotina betaherpesvirus 1
  • Cebina betaherpesvirus 1
  • Cercopithecina betaherpesvirus 5
  • Betaherpesvirus humano 5
  • Betaherpesvirus macacino 3
  • Betaherpesvirus macacino 8
  • Mandrilline betaherpesvirus 1
  • Panine betaherpesvirus 2
  • Papiine betaherpesvirus 3
  • Papiine betaherpesvirus 4
  • Saimiriine betaherpesvirus 4

Virus en Citomegalovirus están envueltos, con geometrías icosaédricas, esféricas a pleomórficas y redondas, y simetría T = 16. El diámetro es de alrededor de 150 a 200 nm. Los genomas son lineales y no segmentados, alrededor de 200 kb de longitud. [4]

Género Estructura Simetría Cápside Arreglo genómico Segmentación genómica
Citomegalovirus Pleomórfico esférico T = 16 Envuelto Lineal Monopartita

Los herpesvirus tienen algunos de los genomas más grandes entre los virus humanos, y a menudo codifican cientos de proteínas. Por ejemplo, el genoma del ADN bicatenario (dsDNA) de las cepas de HCMV de tipo salvaje tiene un tamaño de alrededor de 235 kb y codifica al menos 208 proteínas. Por tanto, es más largo que todos los demás herpesvirus humanos y uno de los genomas más largos de todos los virus humanos en general. Tiene la arquitectura característica del genoma del herpesvirus de clase E, que consta de dos regiones únicas (UL larga única y única corta EE. UU.), Ambas flanqueadas por un par de repeticiones invertidas (TRL / IRL largo de repetición terminal / interna y repetición interna / terminal corta IRS / TRS). Ambos conjuntos de repeticiones comparten una región de unos pocos cientos de bps, la denominada "secuencia a"; las otras regiones de las repeticiones se denominan a veces "secuencia b" y "secuencia c". [12]

La replicación viral es nuclear y lisogénica. La entrada en la célula huésped se logra mediante la unión de las glicoproteínas virales a los receptores del huésped, lo que media la endocitosis. La replicación sigue el modelo de replicación bidireccional de dsDNA. La transcripción con plantilla de ADN, con algún mecanismo de empalme alternativo, es el método de transcripción. La traducción se realiza mediante escaneo con fugas. El virus sale de la célula huésped por la salida nuclear y la gemación. Los humanos y los monos sirven como huéspedes naturales. Las rutas de transmisión dependen del contacto con fluidos corporales (como saliva, orina y secreciones genitales) de un individuo infectado. [4] [13]

Género Detalles del anfitrión Tropismo tisular Detalles de la entrada Detalles de lanzamiento Sitio de replicación Sitio de montaje Transmisión
Citomegalovirus humanos monos Mucosa epitelial Glicoproteínas En ciernes Núcleo Núcleo Saliva en orina

Todos los virus del herpes comparten la capacidad característica de permanecer latentes en el cuerpo durante períodos prolongados. Aunque pueden encontrarse en todo el cuerpo, las infecciones por CMV se asocian con frecuencia con las glándulas salivales en humanos y otros mamíferos. [7]

El promotor de CMV se incluye comúnmente en vectores utilizados en trabajos de ingeniería genética realizados en células de mamíferos, ya que es un promotor fuerte e impulsa la expresión constitutiva de genes bajo su control. [14]

Citomegalovirus fue observado por primera vez por el patólogo alemán Hugo Ribbert en 1881 cuando notó células agrandadas con núcleos agrandados presentes en las células de un bebé. [15] Años más tarde, entre 1956 y 1957, Thomas Huckle Weller junto con Smith y Rowe aislaron de forma independiente el virus, conocido en lo sucesivo como "citomegalovirus". [16] En 1990, se publicó el primer borrador del genoma del citomegalovirus humano, [17] el genoma contiguo más grande secuenciado en ese momento. [18]


Abstracto

Hemos investigado la actividad transcripcional del citomegalovirus humano, la timidina quinasa del herpes, la gonadotropina α coriónica humana, la somatostatina, la cadena κ de inmunoglobulina, la cristalina α, la albúmina y los promotores de interferón-β en la levadura de fisión. Schizosaccharomyces pombe. Entre estos, se encontró que los promotores de citomegalovirus humano, gonadotropina coriónica α humana y somatostatina eran muy activos, aproximadamente 11, 9 y 0,9 veces más activos que el promotor temprano de SV40, respectivamente. El resto de los promotores estudiados eran débiles, teniendo sólo un 10-20% de la actividad del promotor de SV40. El análisis de extensión del cebador mostró que los promotores fuertes iniciaron la transcripción en S. pombe en los mismos sitios que en las células de mamíferos, lo que indica la alta similitud entre ambos sistemas transcripcionales.


El promotor específico de la espermátide del gen SP-10 funciona como aislante en las células somáticas

Los marcadores de diferenciación espermátida, como la proteína acrosómica SP-10, muestran una notable expresión génica restringida a testículos y células germinales. Sin embargo, se sabe poco sobre los mecanismos que impiden su expresión en los tejidos somáticos. Anteriormente hemos observado que el promotor -408 / + 28 o -266 / + 28 de SP-10 dirigió la transcripción estrictamente específica de espermátidas en ratones transgénicos, Biol. Reprod. 61, 1256-1266). Lack of ectopic expression in these mouse lines implied that the SP-10 promoter might have protected the transgene from the influence of neighboring enhancers. The present study tested this directly by performing enhancer-blocking assays. In transiently transfected COS cells, the -408/-92 SP-10 promoter, but not stuffer DNA, blocked the transcriptional activity of a heterologous enhancer (CMV) in a position- and orientation-dependent manner. In transgenic mice, despite integration adjacent to the pan-active CMV enhancer, the -408/+28 promoter maintained spermatid-specificity and no ectopic expression of the transgene resulted. Enhancer blocking is a characteristic feature of insulators. Our results show that the SP-10 proximal promoter, which activates transcription in spermatids, functions as an insulator in somatic cells. Insulator activity mapped to the -186/-135 region and mutation of two ACACAC motifs compromised the insulator function. In conclusion, the evolutionarily conserved SP-10 insulator is novel and is the first one shown to regulate transcription of a germ cell differentiation marker.


The Molecular Basis of Endocrinology

Transcription

RNA polymerase II binds downstream of the TATA box and initiates transcription of the RNA copy of one strand of the gene. Transcription continues some way downstream of the end of the gene and the transcript is processed while being exported from the nucleus. The 5′–end is modified (capped), introns are removed (splicing) and the 3′–end is trimmed and tailed with 5- to 25-adenosine residues (polyadenylation).

RNA processing

The splicing process involves a complex series of reactions catalysed by a set of small nuclear ribonuclear protein particles (SNRPS pronounced snurps). These recognize sequences at the ends of introns enabling the precise removal of the intron sequence with reconnection of the ends of the two exons. The 5′–sequence is: Exon NNNNN^ guaagunnnnn Intron whereas the 3′–sequence is Intron nnnnnnannnnn(c/u)nortecaĝNNNNN Exon. The excised intron forms a lariat in the process ( Figure 2.2) .

Figure 2.2 . Transcription and RNA processing: the primary transcript starts close to the site of RNA polymerase binding and extends beyond the polyadenylation signal. The transcript is cleaved and polyadenylated close to the signal AAUAAA the 5′-end is modified by addition of a deoxyguanosine residue ‘capping’. 5′ untranslated 3′ untranslated

Mutations of the sequences shown are a common cause of genetic disease leading to abnormal processed RNA transcripts which cannot be translated and which are often unstable leading to low levels of RNA.

The splicing reaction may proceed differently in different tissues leading to different mature RNAs and hence different protein products being produced from the same gene in a process known as alternative splicing, the best known example in endocrinology being the calcitonin/CGRP gene in which calcitonin lies on exon 4 and CGRP (calcitonin gene-related peptide) lies on exon 5. In C cells exon 4 is included in the mRNA and its poly(A) addition site is used thus removing CGRP from the mature mRNA, whereas in the nervous system exon 4 is spliced out leaving exon 5 in the mature mRNA which allows translation of CGRP ( Figure 2.3 ).

Figure 2.3 . Calcitonin gene alternate splicing: the calcitonin gene contains six exons exon 4 codes for calcitonin and contains a polyadenylation signal exon 5 codes for CGRP (calcitonin gene-related peptide) and the next polyadenylation site is in exon 6. Splicing in C cells produces an mRNA containing the first four exons and excludes exons 5 and 6, whereas in nerves exon 4 is excluded by a different tissue–specific splicing pattern, giving an mRNA containing exons 1,2,3,5 (CGRP) and 6. The different mRNAs are translated giving calcitonin or CGRP in association with different flanking peptides


Redox Cell Biology and Genetics Part B

Klaus Felix , . Siegfried Janz , in Methods in Enzymology , 2002

Shuttle Vector and Principle of Assay

In the plasmid-based shuttle vector pUR288, lacZ functions as both target and reporter gene of mutagenesis. The 5346-bp vector contains in addition to lacZ-coding sequences the 35-bp binding site for the LacI repressor, lacO, the binding site for CRP (cAMP receptor protein, which facilitates transcription of lacZ by stimulating the formation of an active promoter complex), an origin of replication (ori), and an ampicillin resistance gene ( Fig. 4A ). The principle of the pUR288 mutagenesis assay is illustrated in Fig. 4B . Briefly, shuttle vectors are excised from the transgenic concatemer by restriction with HindIII. Linearized plasmids are then separated from bulk genomic DNA with the help of magnetic beads that are coated with a LacI fusion protein that can bind to the lacO sequence of the plasmid. 4 Elution from the beads is achieved by adding isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG), an inactivator of LacI that induces an affinity decreasing conformational change in the protein for lacO. Plasmids are circularized at the cohesive HindIII sites by ligation with T4 ligase and then electroporated into E. coli that is (1) deficient in β-Gal (lacZ − ), (2) galactose intolerant due to the absence of galactose epimerase (galE − ), and (3) restriction negative to prevent the degradation of incoming methylated plasmid DNA. los galE − mutation is key 12 because it allows for the positive selection of lacZ − mutants in the presence of the lactose analog P-Gal (phenyl-β-D galactoside), a substrate for β-Gal. LacZ − mutants are unable to cleave P-Gal in contrast, wild-type LacZ + cells are able to cleave it, and thereby release galactose. Galactose is converted to UDP-galactoside, which cannot be further metabolized on the galE − background instead, it is accumulated intra-cellularly to toxic and eventually lytic concentrations. Thus, whereas LacZ + cells are prevented from growth on P-Gal-supplemented agar plates, LacZ − cells are not. To determine the rescue efficiency of plasmids from genomic DNA, a small aliquot (usually 2 ΜL) of a 2-ml suspension of pUR288-transfected E. coli is plated on a titer plate that has been supplemented with 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal). X-Gal is cleaved by β-Gal, which produces a blue halo around growing LacZ + colonies. Note that LacZ − mutants will be missed on the dilution plate (no blue halo), but this is negligible because the ratio between LacZ + to LacZ − colonies is on the order of 10 4 :1. Note further that the cleavage of X-Gal releases galactose, which is converted to the same toxic UDP-galactoside derived from P-Gal however, the amounts of galactose liberated from X-Gal are small and therefore compatible with the growth of LacZ + colonies [the molar concentration of X-Gal (183 μM 75 μg/ml) is 64 times lower than that of P-Gal (11.7 mMETRO, 3 mg/ml)]. The remaining part of the suspension (1998 μl) is plated on a single P-Gal plate to select for mutants. Mutants grow as small, red, formazan-stained colonies in the presence of a tetrazolium salt that should be added for improved visibility of the sometimes tiny colonies. The mutant frequency is calculated as the ratio of mutants to nonmutants that is, the number of colonies on the P-Gal selection plate to the number of colonies (×1000) on the X-Gal titer plate. To characterize the mutational spectrum, mutant colonies can be picked and used directly as templates in long-range PCR amplifications of the entire lacZ gene. The PCR fragments are useful for restriction analysis and DNA sequencing. Plasmid DNA minipreparations are equally useful if it is decided not to use PCR for template preparation. Excellent reviews of the pUR288 assay including detailed protocols and sections on troubleshooting are available. 13–15 More specialized articles on the detection of so-called color mutants, 16 the nature of background mutations, 17 and sources of assay variability 18 have also been published. In addition, a commercial kit-based version of the assay—together with technical support, a step-by-step protocol, and accessory services, such as mutational analysis by DNA sequencing and two-dimensional electrophoresis—is being offered by Leven ( www.leveninc.com ). Our overall experience with the assay is positive, but attention must be paid to preparing DNA of high quality [even small amounts of impurities (proteins, salts, organic solvents) can sometimes decrease the rescue efficiency of the shuttle vector] and avoiding contamination with unrelated plasmids that are lacZ − , lacO + , and ampicillin resistant. Plasmids of this nature (e.g., derivatives of pBluescript) are in widespread use in many laboratories, and they can easily show up as false “pUR288 mutants” after finding their way into reagents or laboratory space where the mutagenesis assay is performed.

Fig. 4 . En vivo mutagenesis assay, using pUR288. (A) Plasmid-derived shuttle vector pUR288. CRP, cAMP receptor protein ori, origin of replication lacZ, gene encoding β-Gal HindIII, restriction site used to release the plasmid from genomic DNA. (B) Principle of the assay: LacZ− mutants are positively selected on P-Gal plates. See text for additional details.


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